Render Target: STATIC
Render Timestamp:
6/4/2026, 5:48:45 AM EDT
6/4/2026, 9:48:45 AM UTC
Commit: 33ae406c5df2bbc7a7d3c17605228fbeff8ea416
Cell Signaling Technologyロゴ - Extra Large
注目情報を見る >>
1% for the planet logo
  1. ホーム /
  2. アプリケーション /
  3. 免疫蛍光染色 /
  4. 免疫染色の概要

免疫染色の概要

はじめに

免疫蛍光染色 (IF) は、固定化した細胞や組織内の標的タンパク質の局在、相対的な発現、活性化状態を研究するために抗体と蛍光検出を使用します。IFは様々な研究分野で広く用いられています。

IFでは、以下などを調べることができます。

  • 解析対象のタンパク質を発現する細胞や組織
  • 解析対象のタンパク質の発現や活性を変化させる要因
  • 解析対象のタンパク質の細胞や組織内の局在
  • 異なる解析対象タンパク質の細胞や組織構造内における空間的関連性

免疫蛍光染色の関連技術は年々進化しています。このため、抗体による標的分子の特異的な認識と蛍光レポーターの検出技術も進化を続け、より高度な細胞特性解析が可能になっています。生体サンプルの保存状態が良いことや、標的抗原に抗体がアクセス可能であることが重要ですが、その他にもサンプル、標的、抗体ごとに異なる課題が生じることがあります。

このページでは、プロトコールの理解やよくある質問、IF実験の設計に関する役立つ情報をまとめています。

適切なIF技術とプロトコールの選択

最適なIF技術やプロトコールは、生体サンプルの種類、サンプルを処理するステップ、標的抗原の特性、使用する抗体によって異なります。

以下の点に注意してください。

  • 培養細胞株、凍結組織、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織を解析できます。
  • 培養細胞株や初代培養細胞を解析する場合、免疫蛍光染色-免疫細胞化学染色 (IF-IC) 検証済み抗体を使用してください。
  • 「免疫組織化学染色 (IHC)」という用語は多くの場合、パラフィン包埋組織と凍結組織の区別なく使用されています。また、検出法についても発色法と蛍光標識の両方を指す場合が多々あります。弊社は、凍結組織 (IF-F) とパラフィン包埋組織を区別しています。
  • FFPE組織サンプルを解析する場合、標的の存在量が多い場合は免疫組織化学染色検証済み抗体 (IHC-P) を用い、シグナルを増幅することなく検出できます。マルチプレックスIHC (mIHC) でシグナルを増幅して検出することもできます。
  • 抗体は上に記載した1つ以上のアプリケーションで検証されています。推奨プロトコールは、CSTの科学者による検証の試験結果に基づいて作成されています。
  • 製品情報ページから各製品の専用プロトコールをご覧いただけます。IF検証済み抗体が必要であれば、製品ページで「IF」を選択し、IF検証データとプロトコールを確認してください。各抗体の基本情報 (希釈率/ワーキング濃度、検証済みアプリケーション、種交差性、宿主種) は、製品データシートに記載されています。
  • 一般的な共通IFプロトコールも、プロトコールページでご覧いただけます。
  • 蛍光検出が不要な場合は、IHCのページで発色反応による検出法をご覧ください。

IFに用いる抗体の選択：抗体検証の重要性

シグナル強度が強く、バックグラウンドが最小限に抑えられた特異性の高い抗体を用いることが理想的です。使用予定のアプリケーションにおける検証済みの抗体を選択してください。IFにおける抗体検証には、ポジティブ発現およびネガティブ発現系を用いた実験 (ノックアウト細胞株、遺伝学的モデル、CRISPR、RNAi) や、標的タンパク質の局在や翻訳後修飾 (PTM) の実験的操作、プロトコール最適化などがあります。

抗体の性能はアプリケーションによって異なります。例えばウェスタンブロットで高い性能を示す抗体が、IFでも良好な機能を示すとは限りません。新しい抗体の試験を行うと、わずかに非特異的な結合を持つものが見つかります。このような抗体は、IFや他のWB以外のアプリケーションに推奨することは決してありません。さらに、凍結組織の染色で高い性能を示す抗体が、FFPEの染色では良好な性能を示さない場合、またその逆の場合もあり得ます。抗体の感度と性能は、サンプルの固定法や処理、抗体の使用条件によって変化します。

解析する生体サンプルとその調製方法が決まった後にcellsignal.jpで抗体を検索する最も簡単な方法として、まずは適切なアプリケーションを選択してください。その後、検索ワードを入力するか他の特性 (宿主、研究分野など) を選択してさらに絞り込み検索し、必要なアプリケーションで検証されている抗体を選択してください。

IFのコントロール実験の設計

実験のデザインや結果が適切か、また抗体が正しく標的の情報を示しているかを確認する際は、ポジティブコントロールとネガティブコントロール実験が有効です。例えば：

  • 二次抗体のみを用いたコントロールでは、二次抗体の非特異的な結合があるかどうかを確認できます。
  • ノックアウトやRNAi実験、または発現していることおよびしていないことが既知の細胞株を比較することにより、一次抗体の特異性を確認できます。
  • 多重染色する場合も、単染色を実施することによりスペクトルの重複によるバックグラウンドを確認できます。この実験から、2つの抗原が近接する場合に起こる立体障害が染色に影響しないかどうかの情報も取得できます。
  • リン酸化特異的抗体を用いる場合は、サンプルをホスファターゼ処理することで、抗体がIFでリン酸化型の標的のみを認識しているかどうかを確認できます。
  • 固定や透過化処理の問題が疑われる場合は、研究室でこれまで実際に機能していた抗体を試してみることにより、トラブルシューティングに役立つ情報が得られます。

Cell Signaling Technology (CST) の科学者は、抗体の検証プロセスの一環としてこのようなコントロール実験を日常的に行っています (実例はこちら)。お客様の実験モデルでも同様のコントロール実験を設定することを推奨します。これは良好な結果を得るのに困難を感じている場合に特に有効です。

一次抗体と二次抗体、直接染色と間接染色

標的を特異的に認識するのは一次抗体です。二次抗体は、一次抗体の作製に用いられた宿主種に基づいて、一次抗体と結合します。ラビットやマウスで産生された一次抗体は、それぞれ抗ラビット (イムノグロブリン) 抗体、抗マウス (イムノグロブリン) 抗体で検出されます。

一次抗体と蛍光色素で標識した (一次抗体の宿主種に特異的な) 二次抗体​を組み合せて使用する手法を間接染色法と呼びます。一次抗体を蛍光色素で標識して用い、二次抗体を使用せずに染色する手法を直接染色法と呼びます。直接染色法では、実験にかかる時間の短縮が可能であり、同じ宿主種で作製された抗体を複数用いて多重染色できます。間接染色法では、一次抗体1分子に複数の二次抗体が結合するため、シグナルを増幅できるのが利点です。

これらの手法には別のバリエーションもあり、ビオチン標識した一次抗体を蛍光標識したアビジン/ストレプトアビジンと組み合せる手法などがあります。二次抗体として蛍光標識したF (ab’) 2断片 (Fc領域を欠く) を利用することで、バックグラウンドを抑えることができます。mIHCでは、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 標識した二次抗体で、蛍光標識したチラミドの沈着を触媒します。

抗体蛍光色素の選択

抗体蛍光色素の選択

多重染色 (マルチプレックス解析) できる標的/抗体の数

それぞれの標的を波長の異なる (色の異なる) 蛍光色素で標識した複数の抗体で染色し、同時染色 (マルチプレックス解析) できます。間接法の場合、多重染色の限界は、それぞれの一次抗体を染め分けられる蛍光標識二次抗体の数に依存します。アイソタイプの異なるマウス抗体は、各アイソタイプに特異的な二次抗体で染め分けることができ、同時に最大5種類のマウス抗体を染色できます。直接法の場合、それぞれの一次抗体を異なる蛍光色素で標識します。このため、宿主種やアイソタイプの一致する抗体を多重染色に利用できます。また、マウス抗体を用いてマウス組織を染色する場合にも、抗マウス二次抗体で生じるバックグラウンドが問題にならないため、有効な手法になります。

マルチプレックスIF実験を設計する場合は、スペクトルの重複を避けるために、励起光源やフィルターセットなどの蛍光顕微鏡の特性を考慮する必要があります。現在用いられている落射蛍光顕微鏡や共焦点蛍光顕微鏡は通常、3つ以上のチャンネルを区別する機能を備えています。

細胞染色色素やタグと抗体の組み合せ

固定後の細胞や固定可能な生細胞用の細胞染色色素をIFのワークフローに組み込むことができます。標的の細胞内局在を確認する場合はオルガネラ標識もよく利用されます。GFPなどの発現タグも、トランスフェクションした細胞のモニタリングやモザイク実験などでよく利用され、GFPの蛍光シグナルが弱い場合はIFで抗GFP抗体を用いることがあります。細胞染色色素や蛍光タンパク質を使用した場合は、これらによりチャンネルが占有されるため使用できる抗体の数が減ることに注意が必要です。

実験に用いる蛍光色素の選択

実験に用いる蛍光色素の選択は、利用できる励起光源や励起/蛍光フィルターのスペクトル特性に依存します。蛍光の漏れ込みを避けるため、実験を始める前に蛍光色素の励起/蛍光プロファイルを確認してください。CSTは、Alexa Fluor®などの様々な蛍光色素で標識した一次抗体や二次抗体を提供しています。

サンプルの調製

組織

組織切片は、OCT (Optimal Cutting Temperature) コンパウンド中で急速凍結するか、固定してパラフィン包埋することで調製できます。凍結サンプルは、次のステップの前にクリオスタットを用いて薄切し、スライドにはり付けて10-15分間風乾させた後に固定します。FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded) 組織サンプルの場合は、個々の組織タイプによって採取、固定、パラフィン包埋のステップが異なります。

凍結組織とFFPE組織

一般的に、FFPE組織はOCTコンパウンドで包埋された凍結組織より形態がよく保存されます。このため、陽性細胞の数値化や染色どうしの境界の特定が容易になる場合があります。FFPE組織は非常に安定で、組織ブロックを数年保存することができます。また、研究室間の輸送も容易で、ヒトの病理標本に適した処理方法です。

一方、FFPEサンプルの場合、タンパク質分解によって抗原の総量が減少するステップがあり、残った抗原を検出するために賦活化処理が必要です。また、アルデヒドによって自家蛍光が強まります。量の多いタンパク質を除き、残った抗原を間接IFで検出するのは困難であり、適切な染色像を得るためにシグナルの増幅が必要な場合があります。また、抗原の賦活化処理で、通常は検出されない抗原が染色されるようになり、予期しない非特異染色がみられることもあります。エピトープを検出するために特別な賦活化処理が必要な標的もあります。このため、抗体の検証法と使用法を慎重に検討することが重要です。

OCTコンパウンドで包埋した凍結組織の場合は、形態より処理を削減することが優先されます。包埋の前処理が少なく、切片化すると同時に染色の準備が整うのため、最速で免疫染色結果を取得できます。タンパク質分解も少なく、過酷な賦活化処理は不要であり、多くの抗原が抗体に結合できます。シグナルの増幅を必要としないため、組織サンプルの質の影響を大きく受けます。固定の方法 (アルコールやアルデヒド) や処理時間 (転写因子などのいくつかの標的は固定に必要な時間が短い)、組織サンプルの新鮮さ (特に切片化の後) はすべて重要であり、標的ごとに異なります。最後に、凍結組織は切片化した後に固定などの処理を行うため、アッセイデザインをより高度にカスタマイズでき、標的の選択を柔軟に行うことができます。

培養細胞

蛍光顕微鏡に適合した支持体に細胞を播種する必要があります。通常はガラス底面の細胞培養ディッシュやカバーガラス (プラスチック製の細胞培養ディッシュ上にカバーガラスを置いて) を用い、細胞接着をサポートするためにポリリジンや細胞外マトリックス成分でコーティングします。使用する顕微鏡に対応した市販のマルチチャンバースライドガラスを用いることもできます。

培養条件が細胞の健康状態や形態、標的タンパク質の発現や局在に影響を及ぼし、最終的にIFデータの品質に関わることに注意してください。こまめに培地のpH変化や、ストレスの兆候 (多核化した細胞など) を低倍率の顕微鏡観察でチェックし、細胞の健康状態を確認してください。細胞の種類や標的に応じて、細胞密度が適切に保たれていることも重要です。

サンプルの固定

理想的な固定液によって「生きているような」細胞の状態を保持できます。クロスリンクによって細胞内在性の酵素を阻害し、自己分解などの分解プロセスを速やかに停止して抗体が認識する抗原を提示させます。残念ながら、サンプルや抗原を問わず常に理想的な固定ができる方法はありません。同一の標的タンパク質であっても、異なる抗原は異なる挙動を示します。このため、最適プロトコールはサンプルの種類だけでなく、エピトープ (あるいは抗体) によっても異なります。

組織

新鮮な凍結組織の場合、クリオスタットで薄切した後に切片を固定液で処理する必要があります。一方、組織サンプルを初めに経心腔的灌流や浸漬処理で固定して保存することもあり、固定済みのサンプルを凍結してクラオスタットで切片化することもあります。

​FFPE組織処理の場合は、組織をホルマリン (またはアルデヒドベースの固定液) による浸漬固定や上記の灌流を行って保存し、その後にパラフィン包埋や切片化を行います。抗体とのインキュベーションを行う前に、切片を脱パラフィン処理、再水和、抗原の賦活化処理を行う必要があります。これにより、標的分子に抗体がアクセスして結合できるようになります。

細胞

固定操作の直前に、温めた無血清 (タンパク質成分を含まない) 培地やPBSで細胞を洗い、細胞外の沈殿物や細胞残屑を除去します。速やかに固定液に交換し、迅速に固定できます。

アルデヒド固定とアルコール固定

構造の保持を優先させる場合は、ホルムアルデヒド、ホルマリン (溶解したホルムアルデヒドと低濃度のメタノールの混合物)、グルタルアルデヒドなど、アルデヒドベースの固定液がよく使用されます。CSTはほとんどの抗体で4%ホルムアルデヒド (メタノール不含) による固定を推奨しています。アルデヒドは、細胞タンパク質の一級アミンと反応してクロスリンクしてサンプルを安定化します。また、ホスファターゼやプロテアーゼなどの細胞内酵素がクロスリンクによって不活性化します。アルデヒドは、細胞膜を透過して可溶性タンパク質をアルコールよりよく固定できますが、アルデヒドによるクロスリンクで抗原性を失う標的もあります。

メタノールなどの脱水/変性アルコール固定液は、細胞内高分子周辺の水分子と置き換わり、生体内原位置 (in situ) でこれらを変性させて沈着させます。標的タンパク質が変性することで埋没していたエピトープが露出することがあり、一部の抗体についてはアルデヒドによる固定よりこのアプローチの方が有利な場合があります。しかし、脱水固定液は可溶性の抗原や修飾状態に特異的な抗体 (リン酸化特異的抗体など) にはあまり適しません。製品データシートで最適な固定法を確認してください。

透過化試薬の選択

クロスリンク固定液で固定を行った場合、細胞膜は無傷のまま残り、抗体は細胞内抗原にアクセスできません。したがって、細胞外エピトープを認識する抗体を除いて、クロスリンク固定の後は透過化処理をする必要があります。最適な透過化法は抗体によって異なるので、製品ページで推奨プロトコールを確認してください。

固定後にTriton® X-100を用いて透過化するのが一般的です。Triton、NP-40、TWEEN®、Saponin、Digitonin、DOTMACなどの界面活性剤は細胞膜に結合して様々なサイズの「孔 (pore)」を形成し、抗体のアクセスを可能にします。

一方、固定ステップの後、エタノールやメタノールなどのアルコールで透過化処理をすることもあります。これは、クロスリンク固定液による迅速な固定と、タンパク質の中程度の変性と膜の脱脂を組み合わせた方法です。これによって一部の標的のシグナルが改善することがあり、特にオルガネラや細胞骨格に結合する標的に有効です。

多重染色における固定/透過化条件の選択

CSTの推奨プロトコールが異なる抗体を用いて多重染色する場合、どの抗体を最適条件で使用するかの優先順位を付ける必要があるかもしれません。mIHCにおける順序の最適化の例は、こちらの​アプリケーションノート (PDF) に記載されています。スモールスケールの実験で様々なプロトコールを比較した後、実験規模を拡大することを推奨します。

ブロッキング試薬の選択

最も推奨しているのは、5%正常ヤギ血清 (または二次抗体の宿主種と同じ動物種の血清)/PBS/0.3% Triton® X-100です。製品データシートで推奨ブロッキング試薬を確認してください。

サンプルにFc受容体が存在する場合、特異的な標的の認識 (抗原を認識する抗体の可変領域を介した結合) に由来するシグナルのほか、非特異吸着 (抗体の重鎖とFc受容体の結合) に由来するシグナルも検出されます。動物の血清に存在する総IgGは、Fc受容体を遮断し、一次抗体と二次抗体の結合を防ぎ、バックグラウンドノイズを低減します。蛍光標識したF (ab’) 2断片を利用することでも、二次抗体のFc受容体への非特異的結合が抑えられます (しかし、一次抗体による非特異的結合は回避できません)。

ウェスタンブロットなどのその他の抗体ベースの実験では、ブロッキングのステップによって一次抗体や二次抗体が本来の標的以外の部位に低い親和性を示す非特異的結合を抑えることができます。しかし、IFで厳密に試験されたラビットモノクローナル抗体は、ブロッキングの有無に関わらず良好に機能することが経験的に分かっています。結局のところ、バックグラウンドノイズを避けるには、蛍光免疫染色で検証された高品質な抗体を選択することが効果的です。

IFにおける抗体濃度とシグナル/ノイズ (S/N) 比

シグナルとノイズの比率 (S/N比) は、特定のアプリケーションにおける抗体の特異性と感度を示しています。S/N比は、目的の標的分子を発現する細胞の蛍光強度の「シグナル」を、発現の無い細胞の「バックグラウンドノイズ」と比較して算出します。抗体の濃度が低すぎると、蛍光シグナルが暗すぎてバックグラウンドノイズと区別できなくなります。反対に、濃度が高すぎると、バックグラウンドレベルが上昇してS/N比は低下します。毎回、製品のデータシートに記載されている推奨抗体希釈液を確認してください。これは抗体検証ステップで行うタイトレーションに基づくものです。

S/N比

段階希釈した​MUC1 (D9O8K) Rabbit Monoclonal Antibody #14161のS/N比の解析。MFIを発現するZR-75-1細胞 (MFI (+)、橙) と、発現しないHCT 116細胞 (MFI (-)、青) の平均蛍光強度と算出したS/N比を示しています (緑)。

一次抗体の反応時間

一般的に、4℃で一晩インキュベーションすることで強いシグナルが得られます。インキュベーション時間と温度を変えるとシグナルとS/N比が変化します。抗体によってインキュベーションの条件の変化の影響が異なる場合があります。詳細はこの​ブログ記事をご覧ください。

IF解析に用いる蛍光顕微鏡

IFは、適切な励起光源とフィルターを備えていれば落射型蛍光顕微鏡、走査型共焦点顕微鏡、スピニングディスク共焦点顕微鏡のいずれを用いても行うことができます。また、通常は全内部反射蛍光 (TIRF)、ライトシート顕微鏡、一部の超解像技術など、特殊な免疫蛍光検出技術で解析することも可能です。

自動ハイスループットスクリーニング/ハイコンテント解析との適合性

IF-IC検証済み抗体はいずれも、ハイスループットスクリーニング (HCS)/ハイコンテント解析 (HCA)に使用できます。これらの実験は標準的なIF技術に基づいて、自動化されたものです。

IF実験でお困りごとがありましたら、こちらのトラブルシューティングガイドをご覧ください。

Cell Signaling Technology、CSTは、Cell Signaling Technology, Inc.の登録商標です。その他すべての商標は、それぞれの所有者に帰属します。