Illuminaシステム用のCUT&Tag DNAライブラリー調製のプロトコール
次世代シーケンシング (NG-seq) は、CUT&Tag (Cleavage Under Targets and Tagmentation) アッセイの下流の解析に使用 できるハイスループットな手法であり、ゲノム全体 にわたる標的DNAの濃縮の特定や定量が可能です。CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systemsのキットは、IlluminaシステムプラットフォームでのNG-seqに適したマルチプレックスサンプルの 調製に適しています。本キットは、 最大96種類の異なるバーコードを標識したCUT&Tag DNAライブラリーの調製に使用可能であり、これらのライブラリーは、 まとめて一回のシーケンシング反応で解析できます。本製品は、 CUT&Tag pAG-Tn5 (Loaded) #79561を用いて作製されたCUT&Tag DNAサンプルや、ATAC-seqなどの他のタグメンテーションアッセイ で作成されたDNAサンプルにも適しています。本製品は、 SimpleChIP Chromatin IPキット (#9003、#9005、#56383) 由来のChIP-DNA、 CUT®RUN Assay Kit #86652由来のCUT&RUN DNA、CUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) #84647には適合しません。
適合するアッセイキット：
適合しないアッセイキット：
- SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002
- SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
- SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004
- SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
- SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383
- CUT&RUN Assay Kit #86652
- CUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) #84647
- DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795
必要な試薬
キットに含まれる試薬：
- CUT&Tag PCR Master Mix #63228
- CUT&Tag Index 501 Primer for Illumina Systems #84876
- CUT&Tag Index 502 Primer for Illumina Systems #27488
- CUT&Tag Index 503 Primer for Illumina Systems #55058
- CUT&Tag Index 504 Primer for Illumina Systems #61793
- CUT&Tag Index 505 Primer for Illumina Systems #70447
- CUT&Tag Index 506 Primer for Illumina Systems #87803
- CUT&Tag Index 507 Primer for Illumina Systems #26897
- CUT&Tag Index 508 Primer for Illumina Systems #52106
- CUT&Tag Index 701 Primer for Illumina Systems #71100
- CUT&Tag Index 702 Primer for Illumina Systems #88112
- CUT&Tag Index 703 Primer for Illumina Systems #23497
- CUT&Tag Index 704 Primer for Illumina Systems #37884
- CUT&Tag Index 705 Primer for Illumina Systems #50105
- CUT&Tag Index 706 Primer for Illumina Systems #65909
- CUT&Tag Index 707 Primer for Illumina Systems #84796
- CUT&Tag Index 708 Primer for Illumina Systems #17160
- CUT&Tag Index 709 Primer for Illumina Systems #29209
- CUT&Tag Index 710 Primer for Illumina Systems #41919
- CUT&Tag Index 711 Primer for Illumina Systems #54212
- CUT&Tag Index 712 Primer for Illumina Systems #70020
キットに含まれない試薬：
- AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) またはSPRIselect Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
- 80%エタノール (新たに調製したもの)
- 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)
- 磁気ラック/スタンド
- Agilent BioanalyzerまたはTapeStationシステム (Agilent Technologies, Inc.)
- PCRチューブ (またはプレート) とPCR装置
CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems プロトコール
| SAFE STOP | これは、実験操作を中断する 必要がある場合に、プロトコールを安全に中断できるポイントを示します。 |
I. ロープレックスでサンプルをプールする場合のガイドライン：
デュアルインデックスプライマー方式では、異なる8塩基のインデックス配列を含む2種類の プライマーを使用します。Index 7プライマーは、P7配列の隣にインデックス配列を含みます。一方、Index 5プライマーは、P5 配列の隣にインデックス配列を含みます。シーケンスするサンプルの 両端にそれぞれ固有のインデックス配列を付加することにより、デュアルインデックスの検出が可能になります。12種類のIndex 7プライマーと、8種類の Index 5プライマーを組み合わせることにより、最大96種類の異なるサンプルを インデックス化できます。
IlluminaシステムのNG-seqプラットフォームでは、A/Cのシーケンスに赤色レーザー/LEDを、G/Tのシーケンスに緑色 レーザー/LEDを使用しています。サイクルごとに赤と緑の両方の チャンネルで読み取り、これらを用いて画像の正確なレジストレーションを行います (すなわち、各サイクルでAかCの いずれかと、GかTのいずれかが存在する必要があります)。 インデックスリードのシーケンシングの際にこのカラーバランスが保たれていない場合、 解析が失敗する可能性があります。各インデックスのシーケンスをチェックして、 各サイクルの赤と緑のいずれのチャンネルでもシグナルを持つインデックスが使用されているかどうかを確認してください。 以下の例を参照してください：
| 良い例 | |||
|---|---|---|---|
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 7プライマー | Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 5プライマー | ||
| Index 701 |
ATTACTCG |
Index 503 |
CCTATCCT |
| Index 702 |
TCCGGAGA |
Index 504 |
GGCTCTGA |
| Index 703 |
CGCTCATT |
Index 505 |
AGGCGAAG |
| Index 704 |
GAGATTCC |
Index 506 |
TAATCTTA |
| ������������������������ | ������������������������ | ||
| 悪い例 | ||||
|---|---|---|---|---|
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 7プライマー | Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 5プライマー | |||
| Index 701 |
ATTACTCG |
Index 502 |
ATAGAGGC |
|
| Index 702 |
TCCGGAGA |
Index 504 |
GGCTCTGA |
|
| Index 703 |
CGCTCATT |
Index 506 |
TAATCTTA |
|
| Index 704 |
GAGATTCC |
Index 508 |
GTACTGAC |
|
| ������������������������ | ������������������������ | |||
下の表は、一緒にシーケンスできる 有効なインデックスの組み合わせの一部 (すべてではありません) をリスト化したものです。
| Plex | Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 7プライマー | Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 5プライマー |
| 2 |
Index 701、Index 702 Index 703、Index 704 Index 705 、Index 706 Index 707、Index 708 Index 709、Index 710 Index 711、Index 712 |
任意のIndex 5プライマー |
| 3 |
Index 701、Index 702、Index 703 Index 703、Index 704、 Index 705 Index 705、Index 706、Index 707 Index 707、 Index 708、Index 709 Index 709、Index 710、Index 711 |
任意のIndex 5プライマー |
| 4 |
Index 701、Index 702、Index 703、Index 704 Index 703、Index 704、Index 705、Index 706 Index 705、Index 706、Index 707、Index 708 Index 707, Index 708、Index 709、Index 710 Index 709、Index 710、Index 711、Index 712 |
任意のIndex 5プライマー |
| 5-12 | 有効な4プレックスのIndex 7プライマーの組み合わせと、 任意のi7プライマー (必要に応じた数) | 任意のIndex 5プライマー |
| > 12 |
有効な4プレックスのIndex 7プライマーの組み合わせと、 任意のi7プライマー (必要に応じた数) |
Index 501、Index 502、および他のIndex 5プライマー (必要に応じた数) Index 503、Index 504、および他のIndex 5プライマー (必要に応じた数) Index 505、Index 506、および他のIndex 5プライマー (必要に応じた数) Index 507、Index 508、および他のIndex 5プライマー (必要に応じた数) |
その他の有効な組み合わせを下の表にまとめています。CUT&Tag Index 7プライマーとCUT&Tag Index 5 プライマーの有効なセットを選択してください。CUT&Tag Index 7プライマーとCUT&Tag Index 5 プライマーを組み合わせて、ご希望のサンプル数のライブラリー作製 に適したPCR用プライマーセットを選定してください。
| 12サンプルをプールする場合 |
(1) 4種類のIndex 7プライマーセット * 3種類のIndex 5プライマーセット (2) 3種類のIndex 7プライマーのセット * 4種類のIndex 5プライマーのセット (3) 6種類のIndex 7プライマーのセット * 2種類のIndex 5プライマーのセット |
| 26サンプルをプールする場合 |
(1) 6種類のIndex 7プライマーセット * 4種類のIndex 5プライマーセット これに、 任意の2種類のIndex 5プライマー (上記の4種類以外) と組み合わせた任意のIndex 7プライマーを追加してください (2) 6種類のIndex 7プライマーのセット * 5種類の Index 5プライマーのセット この30種類のプライマーペアのうちの26種類を用いて、 26サンプルのライブラリーを増幅してください |
II. Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 5プライマー：
Illuminaシステム用の各CUT&Tag Index 5プライマーは 30 µLの容量 で提供されています。
| 製品 | Index Primerのシーケンス | 得られるIndexプライマーのシーケンスリード |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 501プライマー |
5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTA TAGCCTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
TATAGCCT |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 502プライマー |
5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAT AGAGGCTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
ATAGAGGC |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 503プライマー |
5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCC TATCCTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
CCTATCCT |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 504プライマー |
5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGG CTCTGATCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
GGCTCTGA |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 505プライマー |
5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAG GCGAAGTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
AGGCGAAG |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 506プライマー |
5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTA ATCTTATCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
TAATCTTA |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 507プライマー |
5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCA GGACGTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
CAGGACGT |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 508プライマー |
5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGT ACTGACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
GTACTGAC |
-s-はホスホロチオエート結合を示しています。
III. Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 7プライマー：
Illuminaシステム用の各CUT&Tag Index 7プライマーは 20 µLの 容量で提供されています。
| 製品 | Indexプライマーの配列 | 得られるIndexプライマーのシーケンスリード |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 701プライマー |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGT AATGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
ATTACTCG |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 702プライマー |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCC GGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TCCGGAGA |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 703プライマー |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAATGA GCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
CGCTCATT |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 704プライマー |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAAT CTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
GAGATTCC |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 705プライマー |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTG AATGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
ATTCAGAA |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 706プライマー |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGAA TTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
GAATTCGT |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 707プライマー |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTT CAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
CTGAAGCT |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 708プライマー |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCA TTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TAATGCGC |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 709プライマー |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATAG CCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
CGGCTATG |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 710プライマー |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCGC GGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TCCGCGAA |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 711プライマー |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCG AGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TCTCGCGC |
| Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 712プライマー |
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTATC GCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
AGCGATAG |
-s-はホスホロチオエート結合を示しています。
IV. PCR反応の設定
実験開始前の準備：
- Illuminaシステム用のCUT&Tag IndexプライマーおよびCUT&Tag DNA (または任意の他のタグメンテーションされたDNA) を室温で解凍してください。軽く遠心分離し、チューブの側面に付着した液体をすべて 下に集めてください。
- Index 7プライマーとIndex 5プライマーの有効な組み合わせになっていることを確認してください。 正しいプライマーが 選択されているかを確認する場合は、セクションIとIIを参照してください。
-
以下を、滅菌処理したPCRチューブまたは
PCRプレートのウェルの1つに加えてください。各PCRチューブまたは各ウェルに、加えたCUT&Tag Index 7
プライマーとCUT&Tag Index 5プライマーの情報を記録してください。
試薬 PCR反応1回の分量 (70 µL) CUT&Tag DNA (または任意のタグメンテーションされたDNA) 30 µL CUT&Tag PCR Master Mix 35 µL Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 7 Primer (10 µM) 2.5 µL Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 5 Primer (10 µM) 2.5 µL - ピペッティングで反応液を上下させて完全に混合し、 スピンダウンしてチューブの側面またはウェルの液体をすべて収集してください。
-
ヒートリッドを備えたサーマルサイクラーにチューブをセットし、以下のPCRサイクル条件でPCR
増幅を行ってください：
a. ギャップフィリング 58°Cで5分間 b. ギャップフィリング拡張 72°C、5分間 c. 初期変性 98°C、30秒間 d. 変性 98°C、10秒間 e. アニーリングおよび伸長 60°C、11秒間 CUT&Tag1反応あたり20,000から100,000個の細胞のサンプルに対して、 ステップｄおよびeを合計13サイクル繰り返してください。 CUT&Tag1反応あたり20,000個以下の細胞のサンプルに対しては、ステップ dおよびeを合計14-16サイクル繰り返してください。 注意：PCRサイクルが過剰になると、ライブラリー の多様性の低下や、NGSリードの重複率の上昇につながる場合があります。 f. 最終伸長反応 72°C、1分間 g. 保持 (Hold) 4°C - PCR増幅産物のクリーンアップ (セクションV) に進んでください。(Safe Stop) サンプルを‐20°Cで保存することもできます。
注意：クロスコンタミネーションを避けるために、 チューブ間で異なるチップを使用してください。30 µL未満のCUT&Tag DNAでアッセイを開始する場合は、DNAse-freeの水を添加して全量を最大30 µLにしてください。
注意：クロスコンタミネーションを避けるために、 チューブ間で異なるチップを使用してください。
V. PCR増幅産物のクリーンアップ
実験開始前の準備：
- AMPure XP beadsを使用する場合は、ビーズを室温に戻してください (使用前に少なくとも 30分間は室温で保持してください)。
- チューブの転倒混和またはピペッティングにより、 AMPure XP beadsまたはSPRIselect beadsを再懸濁してください。
- 1サンプルにつき、400 µLの80%エタノールを用意してください。
- 1サンプルにつき、約20 µLの10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) を 調製してください。
- 再懸濁したAMPure beads またはSPRIselect beads 70 µL (1.0X) を、セクションIVのステップ3で調製した70 µLのPCR反応液に加えてください。10回以上、上下に ピペッティングし十分に混合してください。チップ内の液体がすべて排出されるように、 最後の混合は慎重に行ってください。
- サンプルを実験台の上で少なくとも5分間、室 温でインキュベートしてください。
- 適切な磁気スタンドの上にチューブ/プレートを5分間置いて、 上清とビーズを分離させてください。
- 上清を慎重に除去して廃棄してください。標的のDNAが結合したビーズを乱さないように注意しながら、残った液体を すべて除去してください。
- 磁気スタンドに置いたまま、新しく調製した200 µLの80%エタノールをチューブ/プレートに 加えてください。室温で 30秒間インキュベートし、その後に上清を慎重に除去して廃棄してください。DNA標的を含むビーズを 乱さないように注意してください。
- ステップ5をもう一度繰り返し、合計2回洗浄してください。2回目の洗浄後、目に見える すべての液体が取り除かれていることを確認してください。
- チューブ/プレートを 磁気スタンド上に置いた状態で蓋を開け、ビーズを最大5分間風乾してください。
- 注意：ビーズを乾燥させすぎないでください。過度に乾燥させると、DNAの収量が 低下します。ビーズに 光沢を残しつつ、すべての液体が蒸発した状態で、サンプルを溶出してください。ビーズが ひび割れていたら、それは乾燥し過ぎです。磁気スタンド からチューブ/プレートを取り出してください。1サンプルあたり17 µLの 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) を加え、ビーズから標的DNAを溶出してください。ピペッティングで10回上 下させて十分に混合してください。少なくとも2分間、室温でインキュベートしてください。
- チューブ/プレートを磁気スタンド上に置き、5分間静置してください。 標的のDNAを含む上清15 µLを 新しいチューブへ慎重に移してください。(Safe Stop) 使用するまで、DNA ライブラリーを-20°Cで保存できます。
- ライブラリーDNAの濃度を測定してください。
- Agilent社の BioanalyzerまたはTapeStationシステムを使用し、メーカーの 指示に従って、CUT&Tag DNAライブラリーのサイズ分布を解析してください。
- ハイスループットシーケンシング用に、最終的な精製済みライブラリーサンプルの濃度を10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) を用いて調節してください。NGSに必要なライブラリーDNAの最適濃度と容量については、Illumina社の のシーケンシングマニュアルをご参照ください。
注意：増幅されたCUT&Tag DNAライブラリーの収量は、用いるDNA定量法によって 異なります。NanoDropまたは QIAxpert Systemを使用する場合は、予想されるライブラリー濃度は標的がヒストン であれば10-20 ng/µL、ヒストン以外であれば5-12 ng/µLです。NanoDropまたはQIAxpert Systemで測定したライブラリー 濃度が3 ng/µL以下である場合は、サンプルをシーケンシングする前に トラブルシューティングガイド を参照してください。Qubit Fluorometric Quantification systemまたはPicogreenアッセイを使用する場合は、予想されるライブラリー濃度は標的がヒストンであれば 3-10 ng/µL、ヒストン以外 であれば1 ng/µL以下です。
注意：TapeStationシステムでは、Standard ScreenTapeアッセイよりもHigh Sensitivity ScreenTapeアッセイが、 CUT&Tagライブラリーの品質評価に適しています。BioanalyzerまたはTapeStation システムを用いてCUT&Tag DNAライブラリー を解析した際にシグナルが弱い、あるいは全くシグナルがみられない状態であっても、ポジティブコントロールである Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit Monoclonal Antibody #9751が期待されるライブラリー収量 を示す、またはBioanalyzerでピークが得られて実験が全体的に成功していることを示す場合は、NGSに進むことを推奨します (詳細は弊社の CUT&Tagブログを参照してください)。
注意：通常、ヒストンを標的とするCUT&Tag DNAライブラリーは、 ヒストン以外を標的とするDNAライブラリーよりも濃度が高くなります。弊社は、 プール目的で各ライブラリーサンプルを同じ濃度 (nM) に希釈する前に、 次の式を用いてライブラリー濃度をng/µLからnMに 変換しています：濃度 (nM) = 1,000,000 X 濃度 (ng/µL) /ライブラリーの平均サイズ (bp)/660。Bioanalyzer またはTapeStationシステムで、CUT&Tagライブラリー断片の 平均的なサイズを特定できない場合は、サイズを900 bpとして計算し、通常 収量のライブラリーよりも低収量のライブラリーを意図的に多めにプールすることを推奨します。また、 BioanalyzerまたはTapeStationシステムで正常なサイズのピークを示すライブラリーよりも、 5-10 倍多くのフラットなシグナルを持つライブラリーをプールすることを推奨します。これにより、すべてのサンプル間で 読み取り数が均等に分散されます。通常、 NGS用であれば、プールしたDNAライブラリーの濃度は2 nMで十分ですが、濃度はより高い に越したことはありません。