免疫沈降プロトコール (未変性タンパク質)

このプロトコールは、未変性タンパク質を免疫沈降し、ウェスタンブロッティングまたはキナーゼ活性アッセイによる解析を行う場合に使用してください。Protein A Magnetic Beads #70024を使用する場合は、磁気分離の免疫沈降プロトコールを参照してください。

A. 溶液および試薬

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS) #9808：1X PBS 1 Lを調製する場合は、20X PBS 50 mLをdH2O 950 mLに加え、混合してください。
2. 10X Cell Lysis Buffer #9803：1X Cell Lysis Buffer 10 mL調製する場合は、10X Cell Lysis Buffer 1 mLをdH2O 9 mLに加え、混合してください。

   注意：使用直前に1 mM PMSF #8553を加えてください。

3. 3X SDS Sample Buffer：(Blue Loading Buffer Pack #7723) 3X SDS Loading Bufferに1/10量の30X DTTを加え、使用直前に3X Reducing Loading Bufferを調製してください。
4. Protein A/G アガロースビーズ (未標識一次抗体用)：マウスIgGの免疫沈降には、Protein A #37478を使用します。
5. 固相化Streptavidin (Sepharose Bead Conjugate) #3419：バイアルを軽くボルテックスし、免疫沈降1回につき10 µL使用してください。
6. キナーゼアッセイ用10X Kinase Buffer #9802：1X Kinase Bufferを1 mL調製する場合、10X Kinase Buffer 100 µLをdH2O 900 µLに加えて、混合してください。
7. キナーゼアッセイ用ATP (10 mM) #9804：ATP (200 µM) 0.5 mLを調製する場合は、ATP (10 mM) 10 µLを1X Kinase Buffer 490 µLに加えてください。

B. 細胞ライセートの調製

1. 培地を吸引してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 未変性状態で細胞を採取するために、培地を除去し、氷冷した1X PBSで細胞を1回洗浄してください。
3. PBSを除去し、氷冷した1X Cell Lysis Buffer 0.5 mLを各プレート (10 cm) に加え、氷上でプレートを5分間インキュベートしてください。
4. プレートから細胞を掻き取り、微量遠心分離用チューブに移してください。氷上で保持してください。
5. 氷上でサンプルを各5秒間、3回ソニケートしてください。
6. 14,000 x gで10分間、4°Cで遠心分離し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。必要に応じて、ライセートは-80°Cで保存できます。

C. 免疫沈降

細胞ライセートのプレクリア (未標識抗体およびビオチン標識抗体用のオプションステップ)

Protein AビーズやProtein Gビーズ、またはストレプトアビジンビーズへの非特異的なタンパク質の吸着を低減させるために、細胞ライセートのプレクリアステップを実施することを強く推奨します。試験サンプルとアイソタイプコントロールを用意するのに十分な量のライセートに対してプレクリア処理を実施してください。

1. 1 mg/mLの細胞ライセート200 µLに、Protein A 20 µLを加えます。
2. ローテーターを用いて、4°Cで30-60分間インキュベートしてください。
3. 10分間、4°Cで遠心分離してください。上清を新しいチューブに移してください。
4. 使用する一次抗体に応じて、下記の中から適切な手順を選択してください。

免疫沈降

重要：一次抗体の免疫沈降で特異的な結合であることを確認できるように、適切なアイソタイプコントロールの使用を強く推奨します。目的の一次抗体と同じ濃度のアイソタイプコントロールを加えたサンプルを用意し、これらのサンプルを同時に免疫沈降してください。

未標識一次抗体を使用する場合

1. 製品のウェブページまたはデータシートに記載されている推奨希釈率になるように、一次抗体を1 mg/mLの細胞ライセート200 µLに加えてください。穏やかに振盪しながら4°Cで一晩インキュベートしてください。
2. Protein A (#37478) のアガロースビーズ (50%ビーズスラリー 20 µL) を加えてください。穏やかに振盪しながら4°Cで1-3時間インキュベートしてください。
3. 4°Cで30秒間遠心分離してください。ペレットを1X Cell Lysis Buffer 500 µLで5回洗浄してください。洗浄操作は氷上で行ってください。
4. ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼアッセイでの解析に進んでください (セクションD)。

ビオチン標識一次抗体を使用する場合

1. ビオチン標識抗体を、製品のウェブページまたはデータシートに記載されている推奨希釈率になるように1 mg/mLの細胞ライセート 200 µLに加えてください。穏やかに振盪しながら4°Cで一晩インキュベートしてください。
2. Streptavidin (Sepharose Bead Conjugate #3419) を穏やかに混合し、ビーズスラリー10 µLを加えてください。穏やかに振盪しながら4°Cで2時間インキュベートしてください。
3. 4°Cで30秒間遠心分離してください。ペレットを1X Cell Lysis Buffer 500 µLで5回洗浄してください。洗浄操作は氷上で行ってください。
4. ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼアッセイでの解析に進んでください (セクションD)。

固相化抗体 (セファロースビーズ標識) を使用する場合

1. 穏やかに混合した固相化抗体 (ビーズ標識抗体) 10 µLを、1 mg/mLの細胞ライセート200 µLに加えてください。穏やかに振盪しながら4°Cで一晩インキュベートしてください。
2. 4°Cで30秒間遠心分離してください。ペレットを1X Cell Lysis Buffer 500 µLで5回洗浄してください。洗浄操作は氷上で行ってください。
3. ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼアッセイでの解析に進んでください (セクションD)。

固相化抗体 (磁気ビーズ標識) を使用する場合

1. 穏やかに混合した固相化抗体 (ビーズ標識抗体) 10 µLを、1 mg/mLの細胞ライセート 200 µLに加えてください。穏やかに振盪しながら4°Cで一晩インキュベートしてください。
2. チューブをmagnetic separation rack #14654にセットし、磁気ビーズを沈殿させてください。
3. ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼアッセイでの解析に進んでください (セクションD)。

D. サンプルの解析

解析の種類に応じて、下記の適切なステップに進んでください。

注意：磁気ビーズ標識抗体は、遠心分離しないでください。代わりに、Magnetic Separation Rack #14654を使用してください。

ウェスタンブロッティングで解析する場合

1. ペレットを3X SDS Sample Buffer 20-40 µLで再懸濁してください。ボルテックスした後、30秒間遠心分離してください。
2. サンプルを95-100°Cで2-5分間加熱し、14,000 x gで1分間遠心分離してください。
3. サンプル (15-30 µL) をSDS-PAGEゲルにロードしてください。
4. サンプルをウェスタンブロッティングで解析してください。(ウェスタンブロッティングプロトコールを参照してください。)

注意：変性した重鎖による標的のバンドのマスキングや、変性した軽鎖による標的のバンドへの干渉を最小限に抑えるために、以下の二次抗体の使用を推奨します。

標的タンパク質の分子量が約50 kDaの場合：

Mouse Anti-rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) Monoclonal Antibody #45262

Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) Monoclonal Antibody (HRP Conjugate) #93702

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) Monoclonal Antibody #3678

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) Monoclonal Antibody (HRP Conjugate) #5127

標的タンパク質の分子量が約25 kDaの場合：

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) Monoclonal Antibody #3678

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) Monoclonal Antibody (HRP Conjugate) #5127

キナーゼアッセイで解析する場合

1. ペレットを1X Kinase Buffer 500 µLで2回洗浄してください。氷上で保持してください。
2. 200 µM ATPと適切な基質を添加した1X Kinase Buffer 40 µLでペレットを再懸濁してください。
3. 30°Cで30分間インキュベートしてください。
4. 3X SDS Sample Buffer 20 µLで反応を停止させてください。ボルテックスした後、30秒間遠心分離してください。
5. リン酸化基質を含む上清を、新しいチューブに移してください。
6. サンプルを95-100°Cで2-5分間加熱し、14,000 x gで1分間遠心分離してください。
7. サンプル (15-30 µL) をSDS-PAGEゲルにロードしてください。