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56795
SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina®
ChIPキット & 関連製品
ChIP Kit

SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795

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  1. ChIP

Chromatin immunoprecipitations were performed with cross-linked chromatin from 4 x 106 HCT 116 cells and Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751, using SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005. DNA Libraries were prepared from 50 ng, 5 ng, or 0.5 ng enriched ChIP DNA or 50 ng Input DNA using SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538, pooled into one sample, and sequenced on an Illumina® Next-Seq platform. The figure shows binding across GAPDH, a known target gene of H3K4me3. その他のChIP-seqデータについては製品データシートをご覧ください。

Chromatin immunoprecipitations were performed with cross-linked chromatin from 4 x 106 HCT 116 cells and TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569, using SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005. DNA Libraries were prepared from 50 ng, 5 ng, or 0.5 ng enriched ChIP DNA or 50 ng Input DNA using SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538, pooled into one sample, and sequenced on an Illumina® Next-Seq platform. The figure shows binding across CaMK2D, a known target gene of TCF4/TCF7L2. その他のChIP-seqデータについては製品データシートをご覧ください。

出発量の異なるChIP DNAから作成したChIP-seqデータのMetagene解析。Analyses of both Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 (left) and TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569 (right) ChIP-seq data show that the signal-to-noise ratio for peaks identified across entire genome are similar for all three starting amounts of ChIP DNA.

To Purchase # 56795S
製品番号 サイズ 価格 在庫
56795S
1 Kit  (24 assays)

Product Includes Volume (with Count) Storage Temp
End Prep Enzyme Mix 1 x 72 µl -20°C
End Prep Reaction Buffer 1 x 168 µl -20°C
Ligation Enhancer 1 x 24 µl -20°C
Ligation Master Mix 1 x 720 µl -20°C
Q5® PCR Master Mix 1 x 600 µl -20°C

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プロトコール

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ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina®

次世代シーケンシング (NG-seq) はハイスループットな手法であり、これを利用することでクロマチン免疫沈降したサンプルから、標的DNAの特定やその定量をゲノム全体に渡って解析することができます。SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina®には、Illumina®プラットフォームの次世代シーケンシングのため、ChIP DNAから高品質なDNAシーケンシングライブラリーを調製するために必要なすべての酵素とバッファーが含まれています。迅速でわかりやすいワークフローにより、DNAライブラリーの作成と精製に必要な作業時間を短縮することができます。

各キットの構成品は、厳密な品質管理基準を満たす必要があります。各々の新規ロットについて、バーコードでインデックス化されたライブラリーの調製を行い、Illumina® シーケンシングプラットフォームでシーケンシング解析を行うことで、セットになる全試薬が機能することを確認しています。

この製品は、SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580、もしくはSimpleChIP® ChIP-seqMultiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538と一緒に使用する必要があります。この製品には、24回分の反応に十分な量の試薬が含まれ、酵素とソニケーションのどちらで断片化されたChIP DNAでも使用可能です。

Compatible SimpleChIP® kits:
SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383
SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580
SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538

Non-Compatible SimpleChIP® kits:
SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004
Note: Agarose beads are blocked with sonicated salmon sperm DNA, which will contaminate DNA library preps and NG-seq.

Required Reagents
Reagents Included:

  1. (緑) End Prep Enzyme Mix #73416
  2. (緑) End Prep Reaction Buffer #93209
  3. (赤) Ligation Master Mix #46719
  4. (赤) Ligation Enhancer #30147
  5. (青) Q5® PCR Master Mix (2X) #67488 

含まれない試薬:

  1. SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580​、またはSimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538
  2. Nuclease-free Water #12931
  3. AMPure® XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) またはSPRIselect® Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
  4. 80%エタノール (用事調製)
  5. 1X TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA)
  6. 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)
  7. 磁気ラック/スタンド
  8. Bioanalyzer®とAgilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Inc.)、
  9. PCRチューブとPCR機器

I. 末端準備

ChIP-seqをおこなう場合、ChIPアッセイとDNAライブラリー調製で引き起こされるDNA濃縮の実験的バイアスを確認するために、コントロールDNAシーケンシングライブラリーを作成することが必要です。インプットクロマチンから精製されたDNA (すなわち、IP用に使用されたクロマチン) は通常コントロールのDNAライブラリーを作成するために使用されます。出発材料: ChIP DNA 500 pg –1 μg。DNAシーケンシングライブラリーの適切な多様性を確保するため、転写因子または転写コファクターのChIP-seqにはChIPで濃縮されたDNA 5 ngを、Totalヒストンまたはヒストン修飾のChIP-seqにはChIPで濃縮されたDNA 50 ngを、コントロールDNAシーケンシングライブラリーにはインプットDNA 50 ngを使用することを推奨します。必要に応じて、ChIPで濃縮されたDNAは5 ng以下でもライブラリー調製に使用することができますが、増幅によるPCRバイアスによって、ライブラリーの多様性が低下する原因となる場合があります。Before starting:

  • End Prep Enzyme Mix () を室温で解凍してください。
  • 1X TE (10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA) を調製してください。
  1. 滅菌したヌクレアーゼフリーチューブに、ChIP DNA 0.5-50 ngと比較のため input DNA (コントロールDNA) を準備してください。1X TEを加えて、各DNAサンプルに対して最終容量50 μLになるようにしてください。
  2. End Prep Enzyme Mix () 3 μLとEnd Prep Reaction Buffer () 7 μLを、各DNAサンプルに加えて、総反応容量が60 μLになるようにしてください。
  3. ピペッティングで少なくとも10回繰り返して反応液を良く混ぜ合わせ、簡単にスピンダウンすることで、チューブの側面からすべての液体を落としてください。少量の気泡があっても、パフォーマンスにはそれほど影響しません。
  4. サーマルサイクラーにセットし、以下のプログラムを実行してください:
    • 30 min, 20 °C
    • 30 min, 65 °C
    • Hold, 4 °C
  5. アダプターライゲーション (セクションII) へと進んでください。必要に応じて、サンプルは-20℃で保存できますが、収量の低下 (~20%) がみられる可能性があります。プロトコールを中断する前に、アダプターライゲーションまで終わらせることを推奨します。

II. アダプターライゲーション

実験開始前の準備:

  • Illumina® () 用アダプターとUSER酵素 () は両方とも、SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580、またはSimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538に含まれています。
  • Adaptor for Illumina® () を室温で解凍してください。
  • ピペッティングを2、3回繰り返し、ライゲーションマスターミックスを混ぜ合わせてください。
  • 各サンプルに対して、10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) を2.5 μL調製してください。
  1. 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) でAdaptor for Illumina® () を希釈してください。もし開始時のDNA量が5 ngから100 ngの場合は、アダプターを1:10に希釈して、ワーキング濃度が1.5 mMになるようにしてください。開始時のDNA量が5 ngより少ない場合は、アダプターを1:25に希釈して、ワーキング濃度が0.6 mMになるようにしてください。
  2. Add 30 μl Ligation Master Mix (), 1 μl Ligation Enhancer (), and 2.5 μl diluted Adaptor for Illumina® directly to the 60 μl End Prep Reaction Mixture from step 5 in Section I.
    Note: Preparing a reaction premix containing the diluted adaptor ahead of time is NOT recommended.
  3. 少なくとも10回ピペッティングを繰り返してライゲーション反応液を十分に​混和し、簡単にスピンダウンすることで、チューブの側面からすべての液体を落としてください。Ligation Master Mixは非常に粘性があります。混合が不完全な場合、ライゲーション効率が低下するため、ライゲーション反応液は十分に混ぜ合わせてください。少量の気泡があっても、パフォーマンスにはそれほど影響しません。
  4. 室温で15分間インキュベートしてください。
  5. USER Enzyme () 3 μLをライゲーション反応液に加えてください。よく混ぜ合わせた後、ヒートリッドを47℃以上に設定し、37℃で15分間インキュベートしてください。
  6. アダプターライゲーション済みChIP DNAのクリーンアップ (セクション III) へと進んでください。(SAFE STOP) サンプルを‐20℃で保存することができます。

III. サイズ選択をしない、アダプターライゲーション済みChIP DNAのクリーンアップ

ChIP-seq DNAライブラリーの収量と多様性が大きく損なわれるため、アダプターライゲーション済みChIP DNAのクリーンアップの段階で、サイズ選択は推奨しません。

実験開始前の準備:

  • AMPure® XP Beadsを使用する場合、ビーズを室温に戻し、使用前に少なくとも30分間は置いてください。
  • AMPure® XP BeadsまたはSPRIselect®​ Beadsをボルテックスして再懸濁してください。
  • 各サンプルに対して、80%エタノールを400 μL用意してください。
  • 各サンプルに対して、10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) を17 μL用意してください。
  1. 再懸濁したAMPure® XP Beads、またはSPRIselect®​Beads 87 μL (0.9X) を各アダプターライゲーション反応液に加えてください。ピペッティングで少なくとも10回上下させて十分に混ぜ合わせてください。最後の混合時には、チップ内の液体がすべて排出されるように気を付けてください。
  2. サンプルを実験台の上で少なくとも5分間、室温でインキュベートしてください。
  3. 適切な磁気スタンドの上にチューブ/プレートを5分間置いて、上清とビーズを分離してください。
  4. 溶液が透明になったら、注意深く上清を取り除いて捨ててください。DNA標的を含むビーズを乱さないように注意してください。
  5. 磁気スタンドに置いたまま、新しく準備した80%エタノール200 μLをチューブ/プレートに加えてください。室温で30秒間インキュベートして、その後上清を注意深く取り除いて捨ててください。DNA標的を含むビーズを乱さないように注意してください。
  6. ステップ5をもう一度繰り返し、合計2回洗ってください。2回目の洗いの後、目に見える全ての液体が取り除かれていることを確認してください。
  7. チューブ/プレートを磁気スタンド上に置いた状態でフタを開け、ビーズを最大5分間風乾してください。注意:ビーズを乾燥させ過ぎないでください。これにより、DNA標的の回収量が低下します。ビーズにまだ光沢があり、すべての液体が蒸発した状態で、サンプルを溶出してください。ビーズがひび割れしてきたら、それは乾燥し過ぎです。
  8. 磁気スタンドからチューブ/プレートを取り出してください。サンプルあたり10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) 17 μLを加えることで、ビーズからDNA標的を溶出してください。ピペッティングで10回上下させて十分に混ぜ合わせてください。少なくとも2分間、室温でインキュベートしてください。
  9. 磁気スタンド上にチューブ/プレートを置いて、5分間待ってください。溶液が透明になったら、DNA標的を含む上清15 μLを新しいPCRチューブに移してください。アダプターライゲーション済みChIP-DNAのPCR濃縮 (セクション IV) へと進んでください。(SAFE STOP) もしくは、サンプルを‐20℃で保存してください。

IV. アダプターライゲーション済みChIP DNAのPCR濃縮

実験開始前の準備:

  • Universal PCR Primer for Illumina® () とIllumina®​ twelve Index Primers () は、SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580​に含まれています。Single Index Primers (#29580) を使用する際は、PCR反応毎にIndex Primer1つのみ使用してください。有効なバーコードの組み合わせとPCR反応のためのヒントは、#29580のデータシートをご確認ください。
  • 8種類のIndex 5​ Primer for Illumina® (白いキャップ) と、12種類のIndex 7​ Primer for Illumina® (オレンジ色のキャップ) は、SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538​に含まれています。Dual Index Primers (#47538) と使用するには、反応毎に、Index 5​ Primer 1つとIndex 7​ Primer 1つのみを使用してください。有効なバーコードの組み合わせとPCR反応のためのヒントは、#47538のデータシートをご確認ください。
  • プライマーと精製済みのアダプターライゲーション済みChIP DNA断片 (セクションIIIステップ9から) を室温で解凍してください。
  1. 以下の構成品を滅菌処理したPCRチューブに加えてください:
    試薬 PCR反応1回分の必要量 (50 μL)
    精製したアダプターライゲーション済みChIP-DNA断片 (セクションIIIのステップ9から) 15 μL
    Q5® PCR Master Mix () 25 μL
    Single Index Primer for Illumina® () (もしくはDual Index用のDual Index 7 Primer for Illumina® [オレンジ色のキャップ]) 5 μL
    Universal PCR Primer for Illumina® (•) (もしくはDual Index用のDual Index 5 Primer for Illumina® [白色のキャップ]) 5 μL
  2. ピペッティングで10回上下させて反応液を十分に​混ぜ合わせ、簡単にスピンダウンすることで、チューブの側面からすべての液体を落としてください。
  3. チューブをサーマルサイクラーにセットし、以下のPCRサイクル条件でPCR増幅をおこなってください。
    a. 初期変性 98°C, 30 sec
    b. 変性 98°C, 10 sec
    c. アニーリングおよび伸長 65°C, 75 sec
    d.

    出発材料が​50 ngのChIP DNAの場合、Step bとStep cを合計6回繰り返してください。出発材料が​5 ngのChIP DNAの場合、Step bとStep cを合計10回繰り返してください。出発材料が​0.5 ngのChIP DNAの場合、Step bとStep cを合計13回繰り返してください。

    e. 最終伸長反応 65°C, 5 min
    f. 保持 (Hold) 4℃
  4. PCR増幅産物のクリーンアップ (セクションV) へと進んでください。(SAFE STOP) もしくは、サンプルを‐20℃で保存してください。

V. PCR増幅産物のクリーンアップ

実験開始前の準備:

  • AMPure® XP Beadsを使用する場合、ビーズを室温に戻し、使用前に少なくとも30分間は置いてください。
  • AMPure® XP BeadsまたはSPRIselect®​ Beadsをボルテックスして再懸濁してください。
  • 各サンプルに対して、80%エタノールを400 μL用意してください。
  • 各サンプルに対して、10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) を40 μL調製してください。
  1. 再懸濁したAMPure® XP Beads 45 μL (0.9X)、またはSPRIselect®​ Beadsを、セクションIV、ステップ4​からのPCR反応液 50 μLへと加えてください。ピペッティングで少なくとも10回上下させて十分に混ぜ合わせてください。最後の混合時には、チップ内の液体がすべて排出されるように気を付けてください。
  2. サンプルを実験台の上で少なくとも5分間、室温でインキュベートしてください。
  3. 適切な磁気スタンドの上にチューブ/プレートを5分間置いて、上清とビーズを分離してください。
  4. 上清を注意深く除去して捨ててください。DNA標的を含むビーズを乱さないように注意してください。
  5. 磁気スタンドに置いたまま、新しく準備した80%エタノール200 μLをチューブ/プレートに加えてください。室温で30秒間インキュベートして、その後上清を注意深く取り除いて捨ててください。DNA標的を含むビーズを乱さないように注意してください。
  6. ステップ5をもう一度繰り返し、合計2回洗ってください。2回目の洗いの後、目に見える全ての液体が取り除かれていることを確認してください。
  7. チューブ/プレートを磁気スタンド上に置いた状態でフタを開け、ビーズを最大5分間風乾してください。注意:ビーズを乾燥させ過ぎないでください。これにより、DNA標的の回収量が低下します。ビーズにまだ光沢があり、すべての液体が蒸発した状態で、サンプルを溶出してください。ビーズがひび割れしてきたら、それは乾燥し過ぎです。
  8. 磁気スタンドからチューブ/プレートを取り出してください。サンプルあたり10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) 33 μLを加えることで、ビーズからDNA標的を溶出してください。ピペッティングで10回上下させて十分に混ぜ合わせてください。少なくとも2分間、室温でインキュベートしてください。
  9. 磁気スタンド上にチューブ/プレートを置いて、5分間待ってください。注意深く、DNA標的を含む上清 30 μLを新しいチューブへ移してください。(SAFE STOP) ライブラリは-20℃で保存できます。
  10. NanodropまたはPicogreenアッセイで、ライブラリーDNAの濃度を測定してください。DNAライブラリー濃度は10-40 ng/μLの範囲内である必要があります。
  11. ライブラリーDNA 1 μLを10 mM Tris-HClで、最終濃度が5-10 ng/μLになるように希釈してください。希釈済みライブラリーDNAを使用して、メーカーの指示に従って、Agilent Bioanalyzer® High Sensitivity DNAチップを使用してサイズ分布を解析してください。
  12. アダプターダイマー (Single Index Primersではおよそ128 bp、もしくはDual Index Primersではおよそ146 bp) のコンタミネーションが観察された場合は、クリーンアップステップの1-10を繰り返してください。残留しているアダプターやアダプターダイマーは、シーケンシング反応に著しくコンタミネートします。
  13. ハイスループットシーケンシング用に、10 mM Tris-HClで最終的な精製ライブラリーサンプルを希釈してください。NG-seqに必要なライブラリーDNAの最適濃度と容量については、Illumina®のシーケンシングマニュアルをご参照ください。

APPENDIX A:結果の一例

50 ng 5 ng 0.5 ng 50 ng (インプットDNA)

図 1 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005を用いて調製したChIP DNAの異なる出発量から作成した、DNAライブラリーのAgilent Bioanalyzer®​プロファイル。DNAライブラリーは、50 ng、5 ng、0.5 ngの濃縮されたChIP DNAと、50 ngのインプットDNAから作成されました。示されている通り、調製した各DNAライブラリーは、類似したDNA断片サイズを示しました (予測される範囲は300 bp-900 bp)。

ライブラリー ライブラリー収量 (ng) 総リード数 (百万) ゲノムにマッピングされた%リード 同定されたピーク
TCF4/TCF7L2 #2569 (50 ng) 140.8 39.8 97.8 9425
TCF4/TCF7L2 #2569 (5 ng) 187.8 34.4 97.8 10506
TCF4/TCF7L2 #2569 (0.5 ng) 67.3 33.7 96.0 9416
H3K4me3 #9751 (50 ng) 110.7 29.4 98.5 27967
H3K4me3 #9751 (5 ng) 120.5 33.7 98.2 28665
H3K4me3 #9751 (0.5 ng) 44.2 29.4 94.1 32221
インプットDNA (50 ng) 112.2 26.8 97.9 N/A

表 1 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005を用いて調製したChIP DNAの異なる出発量から作成した、DNAシーケンシングライブラリーの比較。ChIPは、4​x106​個のHCT116細胞と、TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569​またはTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751のいずれかを使用して実施しました。ライブラリーは、SimpleChIP®ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina®(Dual Index Primers) #47538​に提供されているDual Index Primerを用いて作成し、1サンプルにプールしてIllumina® Next-Seqプラットフォームでシーケンスしました。示されている通り、特定されたピークの数はChIP DNAの3つのすべての出発量で類似しています。


図 2 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751と、表1に示すChIP DNAの異なる出発量から作成されたChIP-seqデータ。この図は、H3K4me3の既知の標的遺伝子である、GAPDH (下パネル) を含む、染色体12全体にわたる結合 (上パネル) を示しています。両方のデータで示されている通り、ピークパターンとピークの高さは、3つすべてのChIP DNAの出発量で類似しています。


図 3 表1に示された、TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569を使用して得られたChIP-seqデータ。この図は、TCF4/TCF7L2の既知の標的遺伝子である、CaMK2D (下パネル) を含む、染色体4全体にわたる結合 (上パネル) を示しています。両方のデータで示されている通り、ピークパターンとピークの高さは、3つすべてのChIP DNAの出発量で類似しています。


図 4 出発量の異なるChIP DNAから作成したChIP-seqデータのMetagene解析。ゲノム全体にわたって同定されたピークのシグナルノイズ比を示した、Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 (左パネル) とTCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569 (右パネル) のChIP-seqデータの解析では、両方ともChIP DNAの3つのすべての出発量で類似しています。

APPENDIX B:キット構成品の品質管理

I. End Prep Enzyme Mix ()

Description
End Prep Enzyme Mix is optimized to convert 500 pg-1 μg of fragmented DNA to repaired DNA having 5´-phosphorylated, 3´-dA-tailed ends.

品質管理アッセイ

  1. SDS-PAGEでの純度:各酵素のSDS-PAGE解析により、> 95%の純度を確認しています。
  2. エンドヌクレアーゼ活性:この酵素ミックス (最低でも10 µL) と、アッセイバッファーに溶かしたφX174 RF 1 DNA 1 µgを、50 µLの反応液中で37℃、4時間インキュベートしました。アガロースゲル電気泳動で確かめると、RF IIへの変換は10%未満です。
  3. ホスファターゼ活性:2.5 mM p-ニトロフェニルリン酸を含む、タンパク質ホスファターゼアッセイバッファー (1 M、pH 9.8のジエタノールアミンと0.5 mM MgCl2) 中で、この酵素ミックス (最低でも10 μL) を37℃、4時間インキュベートしました。405 nmでの分光光度法によって検出可能なp-ニトロフェニルアニオンは検出されません。
  4. 機能活性 (ヌクレオチド取り込み、リン酸化、dAテーリング):この酵素ミックス 1 μLを用いて、1X End Repair Reactionバッファー中、25℃、20分の処理で、3'と5'の両方のオーバーハングを含むDNA断片 0.5 μgの>95%の末端を、修復およびリン酸することが、キャピラリー電気泳動によって確かめられています。

II. End Prep Reaction Buffer ()

品質管理アッセイ

  1. 16時間のインキュベーション:1X 濃度のこの反応バッファーを含む反応液50 μLとHindIII消化されたLambda DNA 1 μgを37℃で16時間インキュベートした場合、アガロースゲル電気泳動によって検出可能な非特異的ヌクレアーゼ分解はみられません。1X 濃度の反応バッファーを含む反応液50 μLとT3 DNA 1 μgを37℃で16時間インキュベートした場合には、アガロースゲル電気泳動で検出可能なレベルの非特異的ヌクレアーゼ分解はありません。
  2. エンドヌクレアーゼ活性:この反応バッファーを1X濃度でφX174 RF I DNA 1 μgと、反応液50 μL中で、37℃、4時間インキュベートした場合、アガロースゲル電気泳動によって検出されるRF IIへの変換は10%未満です。
  3. RNase活性:この反応バッファーを1X 濃度でFAMラベルされたRNA転写物 40 ngと、37℃で16時間インキュベートした場合、ポリアクリルアミド電気泳動によって検出可能なRNase活性はありません。
  4. ホスファターゼ活性:この反応バッファーを1X 濃度で2.5 mM p-ニトロフェニルリン酸を含むタンパク質ホスファターゼアッセイバッファー (1 M、pH 9.8のジエタノールアミンと0.5 mM MgCl2) 中で、37℃で4時間インキュベートしたところ、405 nmでの分光光度法によって検出可能なp-ニトロフェニルアニオンの産生はありません。

III. Ligation Master Mix ()

Description
Ligation Master Mix is a ready-to-use solution of T4 DNA Ligase, proprietary ligation enhancer, and optimized reaction buffer.

品質管理アッセイ

  1. 16時間のインキュベーション:1X 濃度のLigation Master Mixを含む反応液50 μLとHindIII消化されたLambda DNA 1 μgを37℃で16時間インキュベートした場合、アガロースゲル電気泳動によって検出可能な非特異的ヌクレアーゼ分解はみられません。1X 濃度のLigation Master Mixを含む反応液50 μLとT3 DNA 1 μgを37℃で16時間インキュベートした場合には、アガロースゲル電気泳動による検出可能な非特異的ヌクレアーゼ分解はありません。
  2. エンドヌクレアーゼ活性:Ligation Master Mixを1X 濃度でφX174 RF I DNA 1 μgと、反応液50 μL中で、37℃、4時間インキュベートした場合、アガロースゲル電気泳動によって検出されるRF IIへの変換は10%未満です。
  3. RNase活性:Ligation Master Mixを、1X 濃度でFAMラベルされたRNA転写物40 ngと37℃で16時間インキュベートした場合、ポリアクリルアミド電気泳動によって検出可能なRNase活性はありません。
  4. 形質転換アッセイ:LITMUS™ 28ベクターは、EcoRV切断 (平滑末端)、仔ウシ腸ホスファターゼで処理され、ゲル精製されます。φX174 DNAのHaeIII消化からの平滑末端化インサートは、Ligation Master Mixプロトコールにより3:1のインサート:ベクター比でベクターへと連結されます。ライゲーション製品は記載の通り形質転換されています。各ロットは以下の基準以上を満たしています:

効率 (形質転換体/µg)

Recircularization Insertion
Blunt ends > 1 x 107 > 2.5 x 106
Uncut vector > 1 x 108 N/A

IV. Ligation Enhancer ()

品質管理アッセイ

  1. 16時間のインキュベーション:Ligation Enhancer 1 μLとHindIII消化されたLambda DNA 1 μgを含む反応液50 μLを、37℃で16時間インキュベートした場合、アガロースゲル電気泳動によって検出可能な非特異的ヌクレアーゼ分解はみられません。NEBNext 5´ SR Adaptor 3 1 μLとT3 DNA 1 μgを含む反応液50 μLを37℃で16時間インキュベートした場合には、アガロースゲル電気泳動によって検出可能な非特異的ヌクレアーゼ分解はありません。
  2. エンドヌクレアーゼ活性:Ligation Enhancer 1 μLを含む反応液50 μLをφX174 RF IスーパーコイルDNA 1 μgと、37℃で4時間インキュベートした場合、アガロースゲル電気泳動によって検出されるRF II (ニック分子) への変換は10%未満です。
  3. RNase活性:Ligation Enhancer 1 μL を含む反応液10 μLをRNA転写 40 ngと、37℃で16時間インキュベートした場合、ゲル電気泳動によって検出可能なRNA分解はありません。
  4. ホスファターゼ活性:Ligation Enhancer 1 μLを、2.5 mM、p-ニトロフェニルリン酸を含むタンパク質ホスファターゼアッセイバッファー (1 M、pH 9.8のジエタノールアミンと0.5 mM MgCl2 ) 中で、37℃で4時間インキュベートした場合、405 nmでの分光光度法によって検出可能なp-ニトロフェニルアニオンの産生はありません。

V. Q5® PCR Master Mix (2X) ()

Description
The Q5® PCR Master Mix (2X) is specifically optimized for robust, high fidelity amplification of next-generation sequencing (NGS) libraries, regardless of GC content. マスターミックスのポリメラーゼ構成因子である、Q5 High-Fidelity DNA Polymeraseは、3´→5´エキソヌクレアーゼ活性を持つ新しい耐熱性DNAポリメラーゼで、処理能力増強性のSso7dドメインに融合しています。またQ5は、非常に低いエラー率を示し、Taq DNAポリメラーゼと比較して100分の1未満、パイロコッカス・フリオサス (Pfu) DNAポリメラーゼと比較して約12分の1に抑えられています。マスターミックスのバッファー成分は、たとえGCリッチなアンプリコンでも堅牢な増幅を実現するために最適化されており、さらに通常のNGSワークフローで使用される様々なビーズにも対応しています。これらの特長は、Q5® PCR Master MixがNGSライブラリー調製に最適であることを示します。この便利な2X マスターミックスはdNTPs、Mg++、独自のバッファーを含み、あとはプライマーとDNAテンプレートを追加するだけで確実な増幅が得られます。ホットスタートアプタマーシステムを採用することにより、室温での反応液調製が可能になり、大変便利です。

品質管理アッセイ

  1. 16時間のインキュベーション:Q5® PCR Master Mixを含む反応液50 μLをHindIII消化されたλ DNA 1 μgと、37℃で16時間インキュベートした場合、アガロースゲル電気泳動によって検出可能な非特異的ヌクレアーゼ分解はみられません。Q5® PCR Master MixとT3 DNA 1 μgを含む反応液50 μLを37℃で16時間インキュベートした場合には、アガロースゲル電気泳動で検出可能な非特異的ヌクレアーゼ分解はありません。
  2. ホスファターゼ活性:Q5® PCR Master Mixを、2.5 mM p-ニトロフェニルリン酸を含むタンパク質ホスファターゼアッセイバッファー (1 M、pH 9.8のジエタノールアミンと0.5 mM MgCl2 ) 中で、37°Cで4時間インキュベートした場合、405 nmでの分光光度法によって検出可能なp-ニトロフェニルアニオンの産生はありません。
  3. 機能活性 (マルチプレックスPCR、ビーズ阻害):0.5 μM 4-plexプライマーミックスと1X Q5® PCR Master Mixを含む反応液50 μL中で、カルボキシル化磁気ビーズ有り、もしくは無しで20 ng ゲノムDNAのPCR増幅を30​サイクル行った場合、4種類の期待される増幅産物が生じ、ビーズ存在下での増幅阻害はみられません。

更新:2017年11月

プロトコールID:1624

Protocol Id: 1624

Product Description

次世代シーケンシング (NG-seq) はハイスループットな手法であり、これを利用することでクロマチン免疫沈降したサンプルから、標的DNAの特定やその定量をゲノム全体に渡って解析することができます。SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina®には、Illumina®プラットフォームの次世代シーケンシングのため、ChIP DNAから高品質なDNAシーケンシングライブラリーを調製するために必要なすべての酵素とバッファーが含まれています。迅速でわかりやすいワークフローにより、DNAライブラリーの作成と精製に必要な作業時間を短縮することができます。この製品は、SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580、もしくはSimpleChIP® ChIP-seqMultiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538と一緒に使用する必要があります。

この製品には、24回分の反応に十分な量の試薬が含まれ、酵素とソニケーションのどちらで断片化されたChIP DNAでも使用可能です。This product is compatible with SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003, SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005, and SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383. This product is not compatible with SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002 and SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004 because agarose beads are blocked with sonicated salmon sperm DNA, which will contaminate DNA library preps and NG-seq.

特異性 / 感度

This kit has been validated in combination with SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580 or SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538 to generate qualified DNA libraries using 50 ng, 5 ng, or 0.5 ng ChIP DNA as starting materials. Libraries prepared from different starting amounts of ChIP DNA exhibit similar Bioanalyzer® profiles, genome mapping rates, numbers of identified binding peaks, and signal-to-noise ratios across the whole genome.

バックグラウンド

クロマチン免疫沈降 (ChIP) アッセイは、細胞に自然な状態で存在するクロマチンのタンパク質とDNAとの相互作用を解析するための、強力かつ多機能な手法です (1,2)。This assay can be used to identify multiple proteins associated with a specific region of the genome, or the opposite, to identify the many regions of the genome bound by a particular protein (3-6). It can be used to determine the specific order of recruitment of various proteins to a gene promoter or to "measure" the relative amount of a particular histone modification across an entire gene locus (3,4). In addition to histone proteins, the ChIP assay can be used to analyze binding of transcription factors and co-factors, DNA replication factors and DNA repair proteins. When performing the ChIP assay, cells or tissues are first fixed with formaldehyde, a reversible protein-DNA cross-linking agent that "preserves" the protein-DNA interactions occurring in the cell (1,2). Cells are lysed and chromatin is harvested and fragmented using either sonication or enzymatic digestion. The chromatin is then immunoprecipitated with antibodies specific to a particular protein or histone modification. 目的のタンパク質と結合するDNA配列や、目的のヒストン修飾を受けたDNA配列は、クロスリンクされたクロマチン複合体の一部として共沈降します。すなわち、免疫沈降という選択的なプロセスを経ることで、目的のDNA配列の相対量が濃縮されます。免疫沈降後、タンパク質とDNAを脱クロスリンクし、DNAを精製します。Standard PCR or Quantitative Real-Time PCR can be used to measure the amount of enrichment of a particular DNA sequence by a protein-specific immunoprecipitation (1,2). Alternatively, the ChIP assay can be combined with genomic tiling micro-array (ChIP on chip) techniques, high throughput sequencing, or cloning strategies, all of which allow for genome-wide analysis of protein-DNA interactions and histone modifications (5-8).

  1. Orlando, V. (2000) Trends Biochem Sci 25, 99-104.
  2. Kuo, M.H. and Allis, C.D. (1999) Methods 19, 425-33.
  3. Agalioti, T. et al. (2000) Cell 103, 667-78.
  4. Soutoglou, E. and Talianidis, I. (2002) Science 295, 1901-4.
  5. Mikkelsen, T.S. et al. (2007) Nature 448, 553-60.
  6. Lee, T.I. et al. (2006) Cell 125, 301-13.
  7. Weinmann, A.S. and Farnham, P.J. (2002) Methods 26, 37-47.
  8. Wells, J. and Farnham, P.J. (2002) Methods 26, 48-56.
研究用のみ。診断手順では使用しません。

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