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74929
FastScan™ Total GSK-3α ELISA Kit
ELISAキット
FastScan ELISA Kit

FastScan™ Total GSK-3α ELISA Kit #74929

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図1。Treatment of A-431 cells with EGF stimulates phosphorylation of GSK-3α at Ser21 but does not affect the level of total GSK-3α. The relationship between lysate protein concentration from untreated and EGF-treated A-431 cells and the absorbance at 450 nm using the FastScan™ Total GSK-3α ELISA Kit #74929 is shown in the upper figure. The corresponding western blots using phospho-GSK-3α (Ser21) antibody (left panel) and total GSK-3α antibody (right panel) are shown in the lower figure. After serum starvation, A-431 cells were treated with 100 ng/ml EGF #8916 for 5 minutes at 37°C, and then lysed.

To Purchase # 74929C
製品番号 サイズ 価格 在庫
74929C
1 Kit  (96 assays)

Supporting Data

REACTIVITY H M R Mk

Application Key:

  • W-Western
  • IP-Immunoprecipitation
  • IHC-Immunohistochemistry
  • ChIP-Chromatin Immunoprecipitation
  • IF-Immunofluorescence
  • F-Flow Cytometry
  • E-P-ELISA-Peptide

Species Cross-Reactivity Key:

  • H-Human
  • M-Mouse
  • R-Rat
  • Hm-Hamster
  • Mk-Monkey
  • Mi-Mink
  • C-Chicken
  • Dm-D. melanogaster
  • X-Xenopus
  • Z-Zebrafish
  • B-Bovine
  • Dg-Dog
  • Pg-Pig
  • Sc-S. cerevisiae
  • Ce-C. elegans
  • Hr-Horse
  • All-All Species Expected
Product Includes Volume (with Count) Solution Color
FastScan™ ELISA Microwell Strip Plate, 96 Well 53257 1 x 96 tests
GSK-3α Rabbit Capture mAb 1 x 1 ea Green (Lyophilized)
GSK-3α Rabbit HRP-linked mAb 1 x 1 ea Red (Lyophilized)
FastScan™ ELISA Capture Antibody Diluent 1 x 3 ml
FastScan™ ELISA HRP Antibody Diluent 1 x 3 ml
TMB Substrate 7004 1 x 11 ml
STOP Solution 7002 1 x 11 ml
Sealing Tape 1 x 1 ea
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 1 x 25 ml
FastScan™ ELISA Cell Extraction Buffer (5X) 69905 1 x 10 ml
FastScan™ ELISA Cell Extraction Enhancer Solution (50X) 25243 1 x 1 ml
FastScan™ ELISA Kit #74929 Positive Control Type 2 1 x 1 ea

プロトコール

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FastScan™ ELISA Protocol

A. 溶液および試薬

NOTE: Prepare solutions with deionized/purified water or equivalent.
試薬は実験当日必要な量だけ調製してください。

  1. FastScan™ ELISA Microwell Strip Plate, 96 well (#53257): Bring all to room temperature before opening bag/use. 未使用のマイクロウェルストリップは乾燥材の入った再封可能な元の袋に戻し、4°Cで保管してください。
  2. 1X ELISA Wash Buffer: Prepare by diluting ELISA Wash Buffer (20X) (included in each kit) to 1X with deionized water.
  3. 1X Cell Extraction Buffer: Prepare by diluting FastScan™ ELISA Cell Extraction Buffer (5X) #69905 and FastScan™ ELISA Cell Extraction Enhancer Solution (50X) #25243* to 1X with deionized water. このバッファーは、4℃で短期間 (1-2週間) 保存できます。例えば1X Cell Extraction Bufferを10 mL調製する場合、脱イオン水7.8 mL、FastScan™ ELISA Cell Extraction Buffer (5X) 2 mL、FastScan™ ELISA Cell Extraction Enhancer Solution (50X) 200 μLを混ぜ合わせてください。別法として、1X に希釈したFastScan™ ELISA Cell Extraction Bufferに細胞や組織を懸濁した後、Enhancer Solutionを加えることもできます。1X Cell Extraction Bufferをサンプル希釈液として使用する場合は、使用前に室温に戻すことを推奨します。

*IMPORTANT: The provided FastScan™ ELISA Cell Extraction Enhancer Solution (50X) may precipitate when stored at 4°C. この場合は37°Cで短時間温め、穏やかに攪拌して溶解してください。FastScan™ ELISA Cell Extraction Enhancer Solution (50X) は、沈殿を防ぐために室温で保管することができます。

NOTE: The 1X Cell Extraction Buffer contains phosphatase inhibitors. 細胞溶解の直前に、プロテアーゼ阻害剤を1X Cell Extraction Bufferに追加してください。追加のホスファターゼ阻害剤を加えることもできます (この場合はProtease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) #5872などを別途お求めください)。

  1. FastScan™ ELISA Capture Antibody Diluent: Green diluent for reconstitution of the Capture Antibody.
  2. FastScan™ ELISA HRP Antibody Diluent: Diluent (amber bottle) for reconstitution of the HRP-linked Antibody. 遮光してください。
  3. 4X Capture Antibody: Reconstitute lyophilized Capture Antibody (green colored cake) with 3 mL FastScan™ ELISA Capture Antibody Diluent (green diluent). 穏やかに混合しながら室温で5分間インキュベートし、完全に溶解してください。最良の結果を得るために、溶解後の抗体はなるべく早く使用してください。溶解後未使用の4X Capture Antibodyは、溶解直後に比べるとシグナルがいくらか失われる可能性はありますが、4°Cで最長4週間保存することができます。
  4. 4X HRP-linked Antibody: Reconstitute lyophilized HRP-linked Antibody (red colored cake) with 3 mL FastScan™ ELISA HRP Antibody Diluent. 穏やかに混合しながら室温で5分間インキュベートし、完全に溶解してください。最良の結果を得るために、溶解後の抗体はなるべく早く使用してください。溶解後未使用の4X HRP-linked Antibodyは、溶解直後に比べるとシグナルがいくらか失われる可能性はありますが、4°Cで最長4週間保存することができます。
  5. Antibody Cocktail: Combine equal volumes of the reconstituted 4X Capture and 4X HRP-linked Antibodies immediately prior to assay and mix. 例えば抗体カクテルを6 mL (96ウェルプレート1枚に十分な量) 調製する場合、 4X Capture Antibody 3 mLを4X HRP-linked Antibody 3 mLと混ぜ合わせてください。
  6. Positive Control: Reconstitute 1 vial of lyophilized Positive Control (refer to product datasheet or vial label to determine which type of Positive Control is included with the kit):
    1. For Positive Control Type 1, add 250 μL deionized water.
    2. For Positive Control Type 2, add 500 μL 1X Cell Extraction Buffer.
    穏やかに攪拌して1分間室温に置き、完全に溶解した後、下記の「操作手順」のセクションの行程に従ってください。Positive Controls are recommended to be used immediately after reconstituting, however remaining material may be stored at -80°C (there may be some loss of the positive control signal if freeze/thawed). Positive Controlは、絶対定量の材料ではなく、コントロール試薬として提供されています。

    NOTE: A select number of FastScan™ ELISA kits do not contain a positive control, please refer to Product Includes table on the datasheet for a list of included reagents. Should you need support on how to generate a positive control for those kits, contact CST technical support at support@cellsignal.com.

  7. TMB Substrate (#7004): Bring to room temperature before use.
  8. STOP Solution (#7002): Bring to room temperature before use.

B. 細胞ライセートの調製

接着細胞の場合

  1. 細胞の密度が​80​-90%コンフルエントに達したら培地を吸引除去してください。
  2. 細胞を氷冷した1X PBSで1回洗浄してください。
  3. PBSを取り除き、各プレート (10 cm径) に氷冷した1X Cell Extraction Buffer (必要に応じてプロテアーゼ阻害剤と追加のホスファターゼ阻害剤を添加することを推奨します) を0.5 mL加え、氷上で5分間インキュベートしてください。
  4. 細胞をプレートから掻き取り、適切なチューブに移してください。氷上に保持してください。
  5. ライセートを氷上で超音波処理 (ソニケーション) してください。
  6. 4°Cで5分間遠心分離 (x14,000 rpm) し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。アッセイ1回分ずつに分注し、-80℃で保存してください。

浮遊細胞の場合

  1. 生細胞数が0.5​-1.0x106細胞/mLに達したら、低速遠心分離 (~1200 rpm) で細胞を集め、培地を除去してください。
  2. 氷冷した1X PBSで一回洗浄してください。
  3. 細胞を 1X Cell Extraction Buffer (必要に応じてプロテアーゼ阻害剤と追加のホスファターゼ阻害剤を添加することを推奨します) で溶解してください。増殖培地50 mLから回収した細胞は1X Cell Extractioon Buffer 2.0 mLで溶解できます。
  4. ライセートを氷上で超音波処理 (ソニケーション) してください。
  5. 4°Cで5分間遠心分離 (x14,000 rpm) し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。アッセイ1回分ずつに分注し、-80℃で保存してください。

C. 操作手順

NOTE: Equilibrate all materials and prepared reagents to room temperature prior to running the assay.

  1. 上記 (セクションA) の試薬をすべて調製してください。
  2. サンプルは希釈せずそのまま用いるか、1X Cell Extraction Bufferで適切な濃度に希釈してください。サンプルは次の手順 (3-4) で等量の抗体カクテルと混ぜ合わせるため、2X タンパク質濃度に調製することで終濃度が1X となることにご注意ください。予備実験で適切なライセート濃度を決定していただくことを推奨しますが、開始濃度を選択するための参考情報として各キットのデータシートに感度曲線を掲載しています。感度曲線は、広範なライセート濃度に渡って典型的な結果を示しています。
  3. 適切なウェルに各サンプルまたはPositive controlをそれぞれ50 μL加えてください。
  4. 各ウェルに抗体カクテルを50 μLずつ加えてください。
  5. キットに同梱されているシーリングテープでプレートをシールし、400 rpm (中程度の振盪速度) に設定した振盪装置上で1時間、室温でインキュベートしてください。
  6. テープを静かに取り除いてウェルを洗浄してください:
    1. 廃棄容器にプレートの内容物を捨ててください。
    2. 各ウェルを1X ELISA Wash Buffer 200​​ μLで3回*洗浄してください。それぞれの洗浄操作で加えた1X ELISA Wash Bufferは、ウェルから吸引除去するか、デカントで廃棄してください。各ウェルに残った液を除去するために、プレートを逆さにし新しいペーパータオルで吸い取ってください。ただし、ウェルは完全に乾燥させないように注意してください。
    3. 糸くずの出ないティッシュ (キムワイプ) で全てのウェルの裏側を拭いてください。

*NOTE: Certain FastScan™ ELISA Kits may require additional washes at this step. 追加の洗いが必要な場合は、キットのデータシートにある製品の「説明」欄に明記してあります。

  1. 各ウェルにTMB Substrateを 100 μLずつ加えてください。プレートをテープでシールし、遮光して振盪装置上で (400 rpm、中程度の振盪速度) インキュベートしてください (室温で15分間、または37°Cで10分間)。
  2. 各ウェルにSTOP Solutionを 100 μLずつ加えてください。数秒間静かに振盪してください。

注意:陽性反応の最初の色は青色です。STOP Solutionを加えることで黄色に変わります。

  1. 結果の判定・測定を行なってください:
    1. Visual Determination: Read within 30 min after adding STOP Solution.
    2. 分光光度法判定:糸くずの出ないティッシュでウェルの底面を拭いてください。STOP溶液を加えてから30分以内に吸光度 (450 nm) を測定してください。

更新:2018年5月

改訂日:2019年11月

Protocol Id: 1924

Product Description

The FastScan™ Total GSK-3α ELISA Kit is a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) that detects endogenous levels of GSK-3α. To perform the assay, sample is incubated with a capture antibody conjugated with a proprietary tag and a second detection antibody linked to HRP, forming a sandwich with GSK-3α in solution. This entire complex is immobilized to the plate via an anti-tag antibody. The wells are then washed to remove unbound material. TMB is then added. The magnitude of observed signal is proportional to the quantity of GSK-3α.

*Antibodies in kit are custom formulations specific to kit.

IMPORTANT: This FastScan™ ELISA kit requires 4 washes at Step 6 of the protocol.

特異性 / 感度

The FastScan™ Total GSK-3α ELISA Kit detects endogenous levels of GSK-3α, as shown in Figure 1. This kit detects proteins from the indicated species, as determined through in-house testing, but may also detect homologous proteins from other species.

Species Reactivity:

ヒト, マウス, Rat, Monkey

バックグラウンド

Glycogen synthase kinase-3 (GSK-3) was initially identified as an enzyme that regulates glycogen synthesis in response to insulin (1). GSK-3 is a ubiquitously expressed serine/threonine protein kinase that phosphorylates and inactivates glycogen synthase. GSK-3 is a critical downstream element of the PI3K/Akt cell survival pathway whose activity can be inhibited by Akt-mediated phosphorylation at Ser21 of GSK-3α and Ser9 of GSK-3β (2,3). GSK-3 has been implicated in the regulation of cell fate in Dictyostelium and is a component of the Wnt signaling pathway required for Drosophila, Xenopus, and mammalian development (4). GSK-3 has been shown to regulate cyclin D1 proteolysis and subcellular localization (5).

  1. Welsh, G.I. et al. (1996) Trends Cell Biol 6, 274-9.
  2. Srivastava, A.K. and Pandey, S.K. (1998) Mol Cell Biochem 182, 135-41.
  3. Cross, D.A. et al. Nature 378, 785-9.
  4. Nusse, R. (1997) Cell 89, 321-3.
  5. Diehl, J.A. et al. (1998) Genes Dev 12, 3499-511.

Pathways & Proteins

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研究用のみ。診断手順では使用しません。

Cell Signaling Technology is a trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
FastScan™ ELISA is a trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
U.S. Patents 9,086,407, 9,261,500, and 9,476,874, foreign equivalents, and child patents deriving therefrom.

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