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12070
PathScan® Phospho-c-Abl (Tyr412) Sandwich ELISA Kit
ELISAキット
ELISA Kit

PathScan® Phospho-c-Abl (Tyr412) Sandwich ELISA Kit #12070

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図1。Constitutive phosphorylation of Bcr-Abl and c-Abl in K-562 cells lysed in the presence of phosphatase inhibitors* (phospho lysate) is detected by PathScan® Phospho-c-Abl (Tyr412) Sandwich ELISA Kit #12070. In contrast, a low level of phospho-Bcr-Abl and phospho-c-Abl protein is detected in K-562 cells lysed in the absence of phosphatase inhibitors* (nonphospho lysate). Absorbance at 450 nm is shown in the top figure while corresponding western blots using c-Abl Antibody #2862 (left panel) and Phospho-c-Abl (Tyr412) (247C7) Rabbit mAb #2865 (right panel) are shown in the bottom figure. *Phosphatase inhibitors include sodium pyrophosphate, β-glycerophosphate, and Na3VO4.

図2The relationship between protein concentration of phospho or nonphospho lysates and the absorbance at 450 nm is shown. Unstarved K-562 cells were cultured (106 cells/ml) and lysed with or without addition of phosphatase inhibitors to the lysis buffer (phospho or nonphospho lysate, respectively).

To Purchase # 12070C
製品番号 サイズ 価格 在庫
12070C
1 Kit  (96 assays)

Important Ordering Details

Custom Ordering Details: When ordering five or more kits, please contact us for processing time and pricing at sales@cellsignal.com.

Supporting Data

REACTIVITY H

Application Key:

  • W-Western
  • IP-Immunoprecipitation
  • IHC-Immunohistochemistry
  • ChIP-Chromatin Immunoprecipitation
  • IF-Immunofluorescence
  • F-Flow Cytometry
  • E-P-ELISA-Peptide

Species Cross-Reactivity Key:

  • H-Human
  • M-Mouse
  • R-Rat
  • Hm-Hamster
  • Mk-Monkey
  • Mi-Mink
  • C-Chicken
  • Dm-D. melanogaster
  • X-Xenopus
  • Z-Zebrafish
  • B-Bovine
  • Dg-Dog
  • Pg-Pig
  • Sc-S. cerevisiae
  • Ce-C. elegans
  • Hr-Horse
  • All-All Species Expected
Product Includes Volume Solution Color
c-Abl Mouse mAb Coated Microwells 96 tests
Phospho-c-Abl (Tyr412) Rabbit Detection mAb 1 ea Green (Lyophilized)
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (ELISA Formulated) 1 ea Red (Lyophilized)
Detection Antibody Diluent 11 ml
HRP Diluent 11 ml Red
TMB Substrate 7004 11 ml
STOP Solution 7002 11 ml
Sealing Tape 2 ea
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 25 ml
ELISA Sample Diluent 25 ml
Cell Lysis Buffer (10X) 9803 15 ml

Product Description

PathScan® Phospho-c-Abl (Tyr412) Sandwich ELISA Kit is a solid phase sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) that detects endogenous levels of tyrosine-phosphorylated Bcr-Abl and c-Abl proteins. A c-Abl Mouse mAb has been coated on the microwells. After incubation with cell lysates, Bcr-Abl and c-Abl protein (phospho and nonphospho) are captured by the coated antibody. Following extensive washing, a Phospho-c-Abl (Tyr412) Rabbit Detection Antibody is added to detect phospho-Bcr-Abl and phospho-c-Abl protein. Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody is then used to recognize the bound detection antibody. HRP substrate, TMB, is added to develop color. The magnitude of absorbance for the developed color is proportional to the quantity of Bcr-Abl or c-Abl protein phosphorylated at Tyr412.

Antibodies in kit are custom formulations specific to kit.

プロトコール

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ELISA比色分析 (凍結乾燥)

A. 溶液および試薬

注意:溶液は精製水で調製してください。

  1. マイクロウェルストリップ:使用前に、全てを室温に戻してください。
  2. 検出抗体:凍結乾燥した緑色の塊または粉末です。高濃度のストック溶液を調製するため、検出抗体希釈液 (緑色) 1.0 mLを加えてください。穏やかに混合しながら室温で5分間インキュベートし、完全に溶解してください。ワーキング溶液を作成するために、溶解した検出抗体1.0 mLを全て、新しいチューブに入れた検出抗体希釈液10.0 mLに加えて、穏やかに混合してください。未使用のワーキング溶液は4°Cで4週間保存できます。
  3. HRP標識抗体*:凍結乾燥された赤色の塊または粉末です。高濃度のストック溶液を調製するため、HRP希釈液 (赤色) 1.0 mLを加えてください。穏やかに混合しながら室温で5分間インキュベートし、完全に溶解してください。ワーキング溶液を調製するために、溶解したHRP標識抗体1.0 mLを全て、新しいチューブ中に入れたHRP希釈液10.0 mLに加えて、穏やかに混合してください。未使用のワーキング溶液は4°Cで4週間保存できます。
  4. ​Detection Antibody Diluent:検出抗体を溶解、希釈する緑色の希釈液です (11 mL)。
  5. HRP Diluent:HRP標識抗体を溶解および希釈する赤色の希釈液です (11 mL)。
  6. ​Sample Diluent:細胞ライセートを希釈する青色の希釈液です。
  7. 1X Wash Buffer:PathScan®​Sandwich ELISAキットに同梱されている20X Wash Bufferを精製水で希釈してください。
  8. Cell Lysis Buffer10X Cell Lysis Buffer #9803:このバッファーは4℃で短期間 (1–2週間) 保存できます。使用直前に、終濃度1 mMのフッ化フェニルメチルスルホニル (PMSF) を加えることを推奨します。
  9. TMB基質 (#7004)
  10. STOP溶液 (#7002)

*注意:いくつかのPathScan® ELISAキットには、HRP標識抗体の代わりにHRP-Linked Streptavidinが含まれています。

B. 細胞ライセートの調製

接着細胞の場合

  1. 密度が​80​-90%コンフルエントの細胞を用意し、培地を吸引除去してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 細胞を氷冷した1X PBSで1回洗浄してください。
  3. PBSを除去し、各プレート (10 cm径) に氷冷した1X Cell Lysis Buffer + 1 mM PMSF混合液0.5 mLを加え、プレートを氷上で5分間インキュベートしてください。
  4. 細胞をプレートから掻き取り、適切なチューブに移してください。氷上に保持してください。
  5. ライセートを氷上で超音波処理 (ソニケーション) してください。
  6. 4°Cで10分間遠心分離 (x14,000 rpm) し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。アッセイ1回分ずつに分注し、-80℃で保存してください。

浮遊細胞の場合

  1. 解析対象となる細胞を増殖させ、生細胞密度が0.5​-1.0 x 106細胞/mLに達したら、低速遠心分離 (~1200 rpm) で細胞を集め、培地を除去してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 低速遠心分離 (~1200 rpm) により細胞を回収し、5​-10 mLの氷冷した1X PBSで1回洗ってください。
  3. 1X Cell Lysis Buffer (1 mM PMSF添加) を、培養液50 mLから回収した細胞当り2.0 mL加え、溶解してください。
  4. ライセートを氷上で超音波処理 (ソニケーション) してください。
  5. 4°Cで10分間遠心分離 (x14,000 rpm) し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。アッセイ1回分ずつに分注し、-80℃で保存してください。

C. 操作手順

  1. マイクロウェルストリップが室温に戻った後、必要な数のマイクロウェルを折り取ってください。マイクロウェルをストリップホルダーにセットしてください。未使用のマイクロウェルは、保存バッグ中に再度密封して直ちに4°Cで保存してください。
  2. 細胞ライセートは、そのまま、あるいは各PathScan® ​Sandwich ELISAキットに含まれてる青色のサンプル希釈液により希釈して、使用してください。予備実験で適切なライセート濃度を決定していただくことを推奨しますが、開始濃度を選択するための参考情報として各キットのデータシートに感度曲線を掲載しています。感度曲線は、広範なライセート濃度でのキットごとのアッセイ結果を示しています。
  3. 適切なウェルに、未希釈、あるいは希釈した各細胞ライセート100 μLを加えてください。テープで密封し、マイクロウェルの上からきつく押し付けてください。プレートを37°Cで2時間インキュベートしてください。あるいは、プレートを4°Cで一晩インキュベートすることも可能です。
  4. テープを静かに取り除いてウェルを洗浄してください:
    1. 廃棄容器にプレートの内容物を捨ててください。
    2. 各ウェルを1X Wash Buffer ​​200 μLで4回、洗ってください。
    3. 各洗いの操作で、各ウェルに残った液を除去するために、十分な強さでプレートを新しいペーパータオルに叩きつけてください。ただし、常にウェルを乾燥させないようにしてください。
    4. 糸くずの出ないティッシュ (キムワイプ) で全てのウェルの裏側を拭いてください。
  5. 各ウェルに、溶解した検出抗体 (緑色) 100 μLを加えてください (セクションA、ステップ 2を参照)。テープで密封し、プレートを37°Cで1時間インキュベートしてください。
  6. 洗いの操作を繰り返してください (セクションC、ステップ4)。
  7. 各ウェルに、溶解したHRP標識二次抗体 (赤色) 100 μLを加えてください (セクションA、ステップ3を参照)。テープで密封し、プレートを37°Cで30分間インキュベートしてください。
  8. 洗いの操作を繰り返してください (セクションC、ステップ4)。
  9. TMB基質100 μLを各ウェルに加えてください。テープで密封してプレートを37°Cで10分間インキュベートするか、または25°Cで30分間インキュベートしてください。
  10. STOP溶液100 μLを各ウェルに加えてください。数秒間静かに振盪してください。

注意:陽性反応の最初の色は青色です。STOP Solutionを加えることで黄色に変わります。

  1. 結果を測定してください。
    1. 視覚判定:STOP Solutionを加えてから30分以内に結果を判定してください。
    2. 分光光度法判定:糸くずの出ないティッシュでウェルの底面を拭いてください。STOP溶液を加えてから30分以内に吸光度 (450 nm) を測定してください。

更新:2013年11月

Protocol Id: 204

特異性 / 感度

PathScan® Phospho-c-Abl (Tyr412) Sandwich ELISA Kit #12070 recognizes endogenous levels of Bcr-Abl or c-Abl protein when phosphorylated at Tyr412 in human cells, as shown in Figure 1. The kit sensitivity is shown in Figure 2. This kit detects proteins from the indicated species, as determined through in-house testing, but may also detect homologous proteins from other species.

Species Reactivity:

ヒト

バックグラウンド

The c-Abl proto-oncogene encodes a nonreceptor protein tyrosine kinase that is ubiquitously expressed and highly conserved in metazoan evolution. c-Abl protein is distributed in both the nucleus and the cytoplasm of cells. It is implicated in regulating cell proliferation, differentiation, apoptosis, cell adhesion, and stress responses (1-3). c-Abl kinase activity is increased in vivo by diverse physiological stimuli including integrin activation; PDGF stimulation; and binding to c-Jun, Nck, and RFX1 (2,4). The in vivo mechanism for regulation of c-Abl kinase activity is not completely understood. Tyr245 is located in the linker region between the SH2 and catalytic domains. This positioning is conserved among Abl family members. Phosphorylation at Tyr245 is involved in the activation of c-Abl kinase (5). In addition, phosphorylation at Tyr412, which is located in the kinase activation loop of c-Abl, is required for kinase activity (6).

  1. Wang, J.Y. (2000) Oncogene 19, 5643-50.
  2. Van Etten, R.A. (1999) Trends Cell Biol 9, 179-86.
  3. Danial, N.N. and Rothman, P. (2000) Oncogene 19, 2523-31.
  4. Shaul, Y. (2000) Cell Death Differ 7, 10-6.
  5. Brasher, B.B. and Van Etten, R.A. (2000) J Biol Chem 275, 35631-7.
  6. Pluk, H. et al. (2002) Cell 108, 247-259.

Pathways & Proteins

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研究用のみ。診断手順では使用しません。

Cell Signaling Technology is a trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
PathScan is a trademark of Cell Signaling Technology, Inc.

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