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3580
Nanog Antibody
一次抗体
ポリクローナル抗体
  1. Products
  2. Primary Antibodies
  3. Nanog Antibody

Nanog Antibody #3580

Citations (138)
Filter:
  1. WB
  2. IF
  3. F
  4. ChIP
Western blot analysis of extracts from NTERA2 and NCCIT cells using Nanog Antibody.
Confocal immunofluorescent analysis of NTERA2 cells (left) and HeLa cells (right) using Nanog Antibody (green). Actin filaments have been labeled with DY-554 phalloidin (red).
Flow cytometric analysis of HeLa cells (blue) and NTERA2 cells (green) using Nanog Antibody.
Chromatin immunoprecipitations were performed with cross-linked chromatin from NCCIT cells and either Nanog Antibody or Normal Rabbit IgG #2729 using SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003. The enriched DNA was quantified by real-time PCR using SimpleChIP® Human Oct-4 Promoter Primers #4641, SimpleChIP® Human Sox2 Promoter Primers #4649, and SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486. The amount of immunoprecipitated DNA in each sample is represented as signal relative to the total amount of input chromatin, which is equivalent to one.
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3580S		 100 µl

Bulk & Custom Formulation

Supporting Data

REACTIVITY H
SENSITIVITY Endogenous
MW (kDa) 42
SOURCE Rabbit

Application Key:

  • WB-Western Blot
  • IP-Immunoprecipitation
  • IHC-Immunohistochemistry
  • ChIP-Chromatin Immunoprecipitation
  • C&R-CUT&RUN
  • C&T-CUT&Tag
  • DB-Dot Blot
  • eCLIP-eCLIP
  • IF-Immunofluorescence
  • F-Flow Cytometry

Species Cross-Reactivity Key:

  • H-Human
  • M-Mouse
  • R-Rat
  • Hm-Hamster
  • Mk-Monkey
  • Vir-Virus
  • Mi-Mink
  • C-Chicken
  • Dm-D. melanogaster
  • X-Xenopus
  • Z-Zebrafish
  • B-Bovine
  • Dg-Dog
  • Pg-Pig
  • Sc-S. cerevisiae
  • Ce-C. elegans
  • Hr-Horse
  • GP-Guinea Pig
  • Rab-Rabbit
  • All-All Species Expected

Product Usage Information

For optimal ChIP results, use 20 μl of antibody and 10 μg of chromatin (approximately 4 x 106 cells) per IP. This antibody has been validated using SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kits.

Application Dilution
Western Blotting 1:1000
Immunofluorescence (Immunocytochemistry) 1:800
Flow Cytometry (Fixed/Permeabilized) 1:400
Chromatin IP 1:25

Storage

Supplied in 10 mM sodium HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 100 µg/ml BSA and 50% glycerol. Store at –20°C. Do not aliquot the antibody.

Protocol

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Western Blotting Protocol

For western blots, incubate membrane with diluted primary antibody in 5% w/v BSA, 1X TBS, 0.1% Tween® 20 at 4°C with gentle shaking, overnight.

NOTE: Please refer to primary antibody product webpage for recommended antibody dilution.

A. Solutions and Reagents

From sample preparation to detection, the reagents you need for your Western Blot are now in one convenient kit: #12957 Western Blotting Application Solutions Kit

NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.

  1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS): (#9808) To prepare 1 L 1X PBS: add 50 ml 20X PBS to 950 ml dH2O, mix.
  2. 10X Tris Buffered Saline (TBS): (#12498) To prepare 1 L 1X TBS: add 100 ml 10X to 900 ml dH2O, mix.
  3. 1X SDS Sample Buffer: Blue Loading Pack (#7722) or Red Loading Pack (#7723) Prepare fresh 3X reducing loading buffer by adding 1/10 volume 30X DTT to 1 volume of 3X SDS loading buffer. Dilute to 1X with dH2O.
  4. 10X Tris-Glycine SDS Running Buffer: (#4050) To prepare 1 L 1X running buffer: add 100 ml 10X running buffer to 900 ml dH2O, mix.
  5. 10X Tris-Glycine Transfer Buffer: (#12539) To prepare 1 L 1X Transfer Buffer: add 100 ml 10X Transfer Buffer to 200 ml methanol + 700 ml dH2O, mix.
  6. 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST): (#9997) To prepare 1 L 1X TBST: add 100 ml 10X TBST to 900 ml dH2O, mix.
  7. Nonfat Dry Milk: (#9999).
  8. Blocking Buffer: 1X TBST with 5% w/v nonfat dry milk; for 150 ml, add 7.5 g nonfat dry milk to 150 ml 1X TBST and mix well.
  9. Wash Buffer: (#9997) 1X TBST.
  10. Bovine Serum Albumin (BSA): (#9998).
  11. Primary Antibody Dilution Buffer: 1X TBST with 5% BSA; for 20 ml, add 1.0 g BSA to 20 ml 1X TBST and mix well.
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack: (#7727).
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa): (#59329).
  14. Blotting Membrane and Paper: (#12369) This protocol has been optimized for nitrocellulose membranes. Pore size 0.2 µm is generally recommended.
  15. Secondary Antibody Conjugated to HRP: Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074).
  16. Detection Reagent: SignalFire™ ECL Reagent (#6883).

B. Protein Blotting

A general protocol for sample preparation.

  1. Treat cells by adding fresh media containing regulator for desired time.
  2. Aspirate media from cultures; wash cells with 1X PBS; aspirate.
  3. Lyse cells by adding 1X SDS sample buffer (100 µl per well of 6-well plate or 500 µl for a 10 cm diameter plate). Immediately scrape the cells off the plate and transfer the extract to a microcentrifuge tube. Keep on ice.
  4. Sonicate for 10–15 sec to complete cell lysis and shear DNA (to reduce sample viscosity).
  5. Heat a 20 µl sample to 95–100°C for 5 min; cool on ice.
  6. Microcentrifuge for 5 min.

  7. Load 20 µl onto SDS-PAGE gel (10 cm x 10 cm).

    NOTE: Loading of prestained molecular weight markers (#59329, 10 µl/lane) to verify electrotransfer and biotinylated protein ladder (#7727, 10 µl/lane) to determine molecular weights are recommended.

  8. Electrotransfer to nitrocellulose membrane (#12369).

C. Membrane Blocking and Antibody Incubations

NOTE: Volumes are for 10 cm x 10 cm (100 cm2) of membrane; for different sized membranes, adjust volumes accordingly.

I. Membrane Blocking

  1. (Optional) After transfer, wash nitrocellulose membrane with 25 ml TBS for 5 min at room temperature.
  2. Incubate membrane in 25 ml of blocking buffer for 1 hr at room temperature.
  3. Wash three times for 5 min each with 15 ml of TBST.

II. Primary Antibody Incubation

  1. Incubate membrane and primary antibody (at the appropriate dilution and diluent as recommended in the product webpage) in 10 ml primary antibody dilution buffer with gentle agitation overnight at 4°C.
  2. Wash three times for 5 min each with 15 ml of TBST.
  3. Incubate membrane with Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074 at 1:2000) and anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075 at 1:1000–1:3000) to detect biotinylated protein markers in 10 ml of blocking buffer with gentle agitation for 1 hr at room temperature.
  4. Wash three times for 5 min each with 15 ml of TBST.
  5. Proceed with detection (Section D).

D. Detection of Proteins

Directions for Use:

  1. Wash membrane-bound HRP (antibody conjugate) three times for 5 minutes in TBST.
  2. Prepare 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883) by diluting one part 2X Reagent A and one part 2X Reagent B (e.g. for 10 ml, add 5 ml Reagent A and 5 ml Reagent B). Mix well.
  3. Incubate substrate with membrane for 1 minute, remove excess solution (membrane remains wet), wrap in plastic and expose to X-ray film.

* Avoid repeated exposure to skin.

posted June 2005

revised June 2020

Protocol Id: 10

Immunofluorescence (Immunocytochemistry)

A. Solutions and Reagents

Achieve higher quality immunofluorescent images using the efficient and cost-effective, pre-made reagents in our #12727 Immunofluorescence Application Solutions Kit

NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.

  1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS): (9808) To prepare 1L 1X PBS: add 50 ml 20X PBS to 950 ml dH2O, mix. Adjust pH to 8.0.
  2. Formaldehyde: 16%, methanol free, Polysciences, Inc. (cat# 18814), use fresh and store opened vials at 4°C in dark, dilute in 1X PBS for use.
  3. Blocking Buffer (1X PBS / 5% normal serum / 0.3% Triton™ X-100): To prepare 10 ml, add 0.5 ml normal serum from the same species as the secondary antibody (e.g., Normal Goat Serum (#5425)) and 0.5 mL 20X PBS to 9.0 mL dH2O, mix well. While stirring, add 30 µl Triton™ X-100.
  4. Antibody Dilution Buffer (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100): To prepare 10 ml, add 30 µl Triton™ X-100 to 10 ml 1X PBS. Mix well then add 0.1 g BSA (9998), mix.

  5. Recommended Fluorochrome-conjugated Anti-Rabbit secondary antibodies:

  6. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071), Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961).

B. Specimen Preparation - Cultured Cell Lines (IF-IC)

NOTE: Cells should be grown, treated, fixed and stained directly in multi-well plates, chamber slides or on coverslips.

  1. Aspirate liquid, then cover cells to a depth of 2–3 mm with 4% formaldehyde diluted in 1X PBS.

    NOTE: Formaldehyde is toxic, use only in a fume hood.

  2. Allow cells to fix for 15 min at room temperature.
  3. Aspirate fixative, rinse three times in 1X PBS for 5 min each.
  4. Proceed with Immunostaining (Section C).

C. Immunostaining

NOTE: All subsequent incubations should be carried out at room temperature unless otherwise noted in a humid light-tight box or covered dish/plate to prevent drying and fluorochrome fading.

  1. Block specimen in Blocking Buffer for 60 min.
  2. While blocking, prepare primary antibody by diluting as indicated on product webpage in Antibody Dilution Buffer.
  3. Aspirate blocking solution, apply diluted primary antibody.
  4. Incubate overnight at 4°C.
  5. Rinse three times in 1X PBS for 5 min each.
  6. Incubate specimen in fluorochrome-conjugated secondary antibody diluted in Antibody Dilution Buffer for 1–2 hr at room temperature in the dark.
  7. Rinse three times in 1X PBS for 5 min each.
  8. Coverslip slides with Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) or Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961).
  9. For best results, allow mountant to cure overnight at room temperature. For long-term storage, store slides flat at 4°C protected from light.

posted November 2006

revised November 2013

Protocol Id: 24

Flow Cytometry, Methanol Permeabilization Protocol for Rabbit Antibodies

A. Solutions and Reagents

All reagents required for this protocol may be efficiently purchased together in our Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593, or individually using the catalog numbers listed below.

NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.

  1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS): To prepare 1 L 1X PBS: add 100 ml 10X PBS (#12528) to 900 ml water mix.
  2. 4% Formaldehyde, Methanol-Free (#47746)
  3. 100% Methanol (#13604): Chill before use
  4. Antibody Dilution Buffer: Purchase ready-to-use Flow Cytometry Antibody Dilution Buffer (#13616), or prepare a 0.5% BSA PBS buffer by dissolving 0.5 g Bovine Serum Albumin (BSA) (#9998) in 100 ml 1X PBS. Store at 4°C.
  5. Recommended Anti-Rabbit secondary antibodies::
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (PE Conjugate) #79408

NOTE: When including fluorescent cellular dyes in your experiment (including viability dyes, DNA dyes, etc.), please refer to the dye product page for the recommended protocol. Visit www.cellsignal.com for a full listing of cellular dyes validated for use in flow cytometry.

B. Fixation

NOTE: Adherent cells or tissue should be dissociated and in single-cell suspension prior to fixation.

NOTE: Optimal centrifugation conditions will vary depending upon cell type and reagent volume. Generally, 150-300g for 1-5 minutes will be sufficient to pellet the cells.

NOTE: If using whole blood, lyse red blood cells and wash by centrifugation prior to fixation.

NOTE: Antibodies targeting CD markers or other extracellular proteins may be added prior to fixation if the epitope is disrupted by formaldehyde and/or methanol. The antibodies will remain bound to the target of interest during the fixation and permeabilization process. However, note that some fluorophores (including PE and APC) are damaged by methanol and thus should not be added prior to permeabilization. Conduct a small-scale experiment if you are unsure.

  1. Pellet cells by centrifugation and remove supernatant.
  2. Resuspend cells in approximately 100 µl 4% formaldehyde per 1 million cells. Mix well to dissociate pellet and prevent cross-linking of individual cells.
  3. Fix for 15 min at room temperature (20-25°C).
  4. Wash by centrifugation with excess 1X PBS. Discard supernatant in appropriate waste container. Resuspend cells in 0.5-1 ml 1X PBS. Proceed to Permeabilization step.
    1. Alternatively, cells may be stored overnight at 4°C in 1X PBS.

C. Permeabilization

  1. Permeabilize cells by adding ice-cold 100% methanol slowly to pre-chilled cells, while gently vortexing, to a final concentration of 90% methanol.
  2. Permeabilize for a minimum of 10 min on ice.
  3. Proceed with immunostaining (Section D) or store cells at -20°C in 90% methanol.

D. Immunostaining

NOTE: Count cells using a hemocytometer or alternative method.

  1. Aliquot desired number of cells into tubes or wells. (Generally, 5x105 to 1x106 cells per assay.)
  2. Wash cells by centrifugation in excess 1X PBS to remove methanol. Discard supernatant in appropriate waste container. Repeat if necessary.
  3. Resuspend cells in 100 µl of diluted primary antibody, prepared in Antibody Dilution Buffer at a recommended dilution or as determined via titration.
  4. Incubate for 1 hr at room temperature.
  5. Wash by centrifugation in Antibody Dilution Buffer or 1X PBS. Discard supernatant. Repeat.
  6. Resuspend cells in 100 µl of diluted fluorochrome-conjugated secondary antibody (prepared in Antibody Dilution Buffer at the recommended dilution).
  7. Incubate for 30 min at room temperature. Protect from light.
  8. Wash by centrifugation in Antibody Dilution Buffer or 1X PBS. Discard supernatant. Repeat.
  9. Resuspend cells in 200-500 µl of 1X PBS and analyze on flow cytometer.

posted July 2009

revised June 2020

Protocol Id: 404

クロマチン免疫沈降

SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005の専用プロトコールです。

必要な試薬

キットに含まれている試薬：

  1. Glycine Solution (10X) #7005
  2. Buffer A (4X) #7006
  3. Buffer B (4X) #7007
  4. ChIP Buffer (10X) #7008
  5. ChIP Elution Buffer (2X) #7009
  6. 5 M NaCl #7010
  7. 0.5 M EDTA #7011
  8. ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006
  9. DNA Binding Buffer #10007
  10. DNA Wash Buffer #10008 (4倍量のエタノールを使用前に加えてください)
  11. DNA Elution Buffer #10009
  12. DNA Purification Columns and Collection Tubes #10010
  13. Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012
  14. RNAse A (10 mg/ml) #7013
  15. Micrococcal Nuclease #10011
  16. Proteinase K (20 mg/ml) #10012
  17. SimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers 1 #7014
  18. SimpleChIP® Mouse RPL30 Intron 2 Primers 1 #7015
  19. Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620
  20. Normal Rabbit IgG #2729
  21. DTT (Dithiothreitol) #7016

キットに含まれない試薬：

  1. Magnetic Separation Rack #7017 / 14654
  2. Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2 (Sterile) #9872
  3. Nuclease-free Water #12931
  4. エタノール (96 - 100%)
  5. ホルムアルデヒド (37%ストック溶液)
  6. SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989
! この ! マークは、免疫沈降 (IP prep) のサンプル数に応じて量の変更する重要ステップであることを意味します。免疫沈降1回分 (1 IP prep) は、4 x 106個の組織培養細胞、または25 mgの破砕した組織に相当します。
!! この !! マークは、操作を進める前にバッファーを希釈する重要なステップであることを意味します。
SAFE STOP これは、実験操作を中断する必要がある場合に、プロトコールを安全に中断できるポイントを示します。

I. 組織のクロスリンクおよびサンプル調製

組織を採取する際、脂肪や壊死組織などの不要な部分を取り除きます。組織サンプルはすぐに使用して直ちにクロスリンクするか、次に使用するまでドライアイスで凍結して-80℃で保存してください。最適なクロマチン収量とChIP結果を得るため、各免疫沈降あたり25 mgの組織を使用します。クロマチン収量は組織の種類により異なるため、一部の組織では各免疫沈降あたり25 mgを超える量が必要となります。組織ごとに予測されるクロマチン収量については、Appendix Aを参照してください。クロマチンの断片化および濃度の解析 (セクションIV) のためにクロマチンサンプルを1本余分に用意してください。必要に応じて5本のクロマチンサンプルを追加で用意し、クロマチン断片化の最適化 (Appendix B) で使用します。

実験開始前の準備：

(!) すべてのバッファーの量は、免疫沈降 (IP prep) のサンプル数に応じて比例的に増やす必要があります。

  • 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) と10X Glycine Solutionを取り出し、室温に戻してください。PICが完全に溶けていることを必ず確認してください。
  • 25 mgの組織に対して、Phosphate Buffered Saline (PBS) 3​​ mL + 200X PIC 15​​ μLの混合液を調製して、氷上に置いてください。
  • 25 mgの組織に対して、37%ホルムアルデヒド45 μLを用意し、室温に置いてください。使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。

A. クロスリンク

  1. 新鮮組織または凍結組織サンプルを計量してください。免疫沈降1回あたり、25 mgの組織を使用します (ポジティブおよびネガティブコントロールも含めると、1回の実験で少なくとも75 mgの組織が必要です)。
  2. 組織サンプルを60 mmまたは100 mmのディッシュに置き、清潔な解剖用メスまたは剃刀の刃で細かく切り刻んでください。シャーレは氷上に置いてください。タンパク質分解を防ぐため、組織をよく冷やす必要があります。
  3. ミンスした組織を、15 mLのコニカルチューブに移してください。
  4. 25 mgの組織に対し、PBS + PIC混合液1 mLを加えてください。
  5. タンパク質をDNAにクロスリンクするため、PBS + PIC混合液1 mLに対し、37%のホルムアルデヒド 45 μLを加え、室温で20分間振盪させてください。ホルムアルデヒドの終濃度は1.5%です。
  6. PBS + PIC混合液1 mLに対して10X Glycine 100 μLを加えてクロスリンクを止め、5分間室温で混和してください。
  7. 組織をベンチトップ遠心分離機を用いて、4℃、500​ x gで5分間遠心分離してください。
  8. 上清を取り除き、25 mgの組織に対しPBS + PIC混合液1 mLで一度洗ってください。
  9. ベンチトップ遠心分離機を用いて、4℃、500​ x gで5分間、再度遠心分離してください。
  10. 上清を取り除き、25 mgの組織に対しPBS + PIC混合液1 mLで再懸濁し、氷上に置いてください。Medimachine (B) あるいはDounce Homogenizer (C) を用いて組織をバラバラにし、単細胞懸濁液を調製してください。(​​SAFE STOP​) もしくは、破砕する前のサンプルを-80℃で3ヵ月まで保存することができます。

B. Medimachine (BD Biosciences：part #340587) を用いた組織破砕

  1. 1000 μLピペットチップの先を切って穴を広げ、組織の塊が通るようにしてください。
  2. PBS + PIC混合液1 mLに再懸濁した組織サンプルを、50 mm Medicone (part #340592) の上部チャンバーに移してください。
  3. メーカーの推奨手順に従い、組織を2分間すり潰してください。
  4. 1 mLのシリンジと先の鈍い18ゲージの注射針を用いて、Mediconeの一番下のチャンバーから細胞懸濁液を集めてください。細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移し、氷上に置いてください。
  5. 組織全体がすり潰されて均質な懸濁液になるまで、ステップ2-4を繰り返してください。
  6. さらにすり潰す必要がある場合、組織サンプルにPBS + PIC混合液を追加してください。組織全体がすり潰されて均質な懸濁液になるまで、ステップ2-5を繰り返してください。
  7. 顕微鏡で単細胞懸濁液であることを確認してください (オプション)。
  8. ベンチトップ遠心分離機を用いて、細胞を4℃、2,000​ x gで5分間遠心分離してください。
  9. 上清を取り除き、続けて細胞核の調製とクロマチン断片化 (セクションIII) に進んでください。

C. Dounce Homogenizerを用いた組織破砕

  1. PBS + PIC混合液に再懸濁した組織をDounce Homogenizerに移してください。
  2. 20-25回ストロークで組織を破砕します。顕微鏡で単細胞懸濁液であることを確認してください (オプション)。
  3. 細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移し、ベンチトップ遠心分離機を用いて4℃、2,000​ x gで5分間遠心分離してください。
  4. 上清を取り除き、続けて細胞核の調製とクロマチン断片化 (セクションIII) に進んでください。

II. 培養細胞のクロスリンクおよびサンプル調製

最適なChIPの結果を得るため、各免疫沈降に対し約4​ x 106個の細胞を使用します。ポジティブコントロールとネガティブコントロールを含めると、少なくとも12​ x 106個の細胞が必要です。HeLa細胞の場合、免疫沈降1回分は増殖培地20 mLで90​%コンフルエントに培養した15 cmディッシュの半分量に相当します。クロマチンサンプルを1本余分に用意し、クロマチンの断片化および濃度についての解析に使用します (セクションIV)。さらに、細胞種ごとに培養ディッシュを1枚余分に用意し、血球計算盤またはセルカウンターを用いて細胞数を計測することを推奨します。

実験開始前の準備

(!) 全てのバッファーの量は、使用する15 cmの組織培養ディッシュ (または20 mLの浮遊細胞) の枚数に応じて、比例的に増やす必要があります。

  • 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012と10X Glycine Solution #7005を取り出し、室温に戻してください。PICが完全に溶けていることを必ず確認してください。
  • 15 cmディッシュ1枚 (または浮遊細胞20 mL) あたり、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2 mL + 200X PIC 10 μLを調製して、氷上に保持してください。
  • 15 cmディッシュ1枚 (または浮遊細胞20 mL) あたり、PBS 40 mLを調製し、氷上に保持してください。
  • 15 cmディッシュ1枚 (または浮遊細胞20 mL) あたり、37%ホルムアルデヒド540 µLを用意し、室温に戻してください。使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。
  1. タンパク質をDNAにクロスリンクするために、20 mLの培地を入れた15 cm培養ディッシュに対して、37%ホルムアルデヒド540 μLを加えてください。浮遊細胞の場合は、37%ホルムアルデヒド540 μLを20 mLの培地に懸濁した細胞に加えてください (浮遊細胞を適切にクロスリンクするため、細胞密度は0.5 x 106細胞/mL未満に調整してください)。手早くディッシュを傾けて混ぜ合わせ、室温で10分間インキュベートしてください。最終的なホルムアルデヒド濃度は1%です。ホルムアルデヒドを加えると、培地の色が変化することがあります。
  2. 10X Glycine Solution 2 mLを、培地が20 mL入ったそれぞれの15 cmディッシュに加え、手早く回して混ぜ合わせ、室温で5分間インキュベートしてください。glycineを加えると、培地の色が変化することがあります。
  3. 浮遊細胞の場合は、細胞を50 mLのコニカルチューブに移し、4℃で500​ x g、5分間遠心分離し、ペレットを氷冷したPBS 20 mLで2度洗ってください。上清を取り除き、直ちに核の調製とクロマチンの断片化 (セクションII) に進んでください。
  4. 接着細胞の場合は、培地を取り除き、細胞を氷冷した1X PBS 20 mLで2回洗ってください。毎回、洗いの液を完全に取り除いてください。
  5. 氷冷したPBS + PIC混合液2 mLを、それぞれの15 cmのディッシュに加えてください。細胞を掻き取り、バッファーに懸濁してください。すべてのディッシュから集めた細胞をコニカルチューブ (15 mL) 1本に集めてください。
  6. ベンチトップ遠心分離機を用いて、細胞を2,000​ x gで5分間、4℃で遠心分離してください。上清を取り除き、直ちに核の調製とクロマチンの断片化 (セクションII) に進んでください。(​​SAFE STOP​) この状態で、サンプルを-80℃で3ヵ月まで保存できます。

III. 核の調製とクロマチンの断片化

実験開始前の準備

(!) すべてのバッファーの量は、免疫沈降 (IP prep) のサンプル数に応じて比例的に増やす必要があります。

  • 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012を取り出し、室温に戻してください。使用前に完全に解凍されていることを確認してください。
  • 1 M DTT (DTT #7016 192.8 mg + 精製水 (dH2O) 1.12 mL) を調製します。DTTの結晶が完全に溶解されていることを確認してください。

    (!!) 重要：溶解したら、1M DTTは-20℃で保存してください。

  • 10X ChIP Buffer #7008を取り出して室温に戻し、SDSが完全に溶解していることを確かめてください。
  • IP prepにつき、1X Buffer A 1 mL (4X Buffer A #7006 250 μL + 水750 μL) + 1M DTT 0.5 μL + 200X PIC 5 μL混合液を調製し、氷上に保持してください。
  • IP prepにつき、1X Buffer B ​1.1 mL (4X Buffer B #7007​​ 275 μL + 水825 μL) + 1M DTT 0.55 μL混合液を調製し、氷上に置いてください。
  • IP prepにつき、1X ChIP Buffer ​100 μL (10X ChIP Buffer #7008 10 μL + 水90 μL) + 200X PIC 0.5 μL混合液を調製し、氷上に保持してください。。
  1. 細胞を、氷冷した1X Buffer A + DTT + PIC混合液1 mL (IP prepにつき) に再懸濁してください。氷上で10分間インキュベートしてください。3分ごとに、チューブを転倒混和してください。
  2. ベンチトップ遠心分離機を用いて2,000​ x gで5分間、4℃で遠心分離し、細胞核を沈殿させてください。上清を取り除き、氷冷した1X Buffer B + DTT混合液1 mL (IP prepにつき) でペレットを再懸濁してください。再度遠心分離して上清を取り除き、ペレットを1X Buffer B + DTT混合液100 µL (IP prepにつき) に再懸濁してください。1.5​ mLの微量遠心分離用チューブに移してください (チューブ1本あたり最大1 mLまで)。
  3. IP prepにつき、Micrococcal Nuclease #10011​ 0.5 μLを加え、数回転倒混和してください。37℃で20分間頻繁に混和しながらインキュベートし、約150-900 bpの長さにDNAを断片化してください。3-5分ごとに転倒混和してください。DNAを最適なサイズに断片化するために必要なMicrococcal Nucleaseの量は、各組織および細胞株の検討結果に基づいて決定しなければならない場合があります (Appendix B参照)。HeLaの細胞核の場合、​4 x 106個の細胞につきMicrococcal Nuclease 0.5 μL、マウス肝臓の場合、25 mgの組織につきMicrococcal Nuclease 0.5 μLを処理すると、適切なサイズのDNA断片に断片化できます。
  4. IP prepにつき、0.5 M EDTA #7011 10 µLを加えて断片化を停止し、1-2分間氷上に置いてください。
  5. 16,000​ x gで1分間、4℃で遠心分離して細胞核を沈殿させ、上清を除去してください。
  6. 核ペレットを、IP prepにつき1X ChIP Buffer + PIC混合液100 μLで再懸濁し、氷上で10分間インキュベートしてください。
  7. 1.5 mLの遠心分離用チューブに、1本あたり最大500 μLまでのライセートを入れ、2、3回ソニケーション処理を行うことで核膜を壊してください。ソニケーション処理の合間に、サンプルを30秒間氷水に浸してください。細胞核を完全に溶解するために必要な最適条件は、ソニケーション処理の前後に細胞核を光学顕微鏡で観察することで決定できます。VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator (1/8-inch probe) の場合、6に設定し、20秒間のソニケーション処理を3​セット行うことで、HeLa細胞の核は完全に破砕されます。代わりに、Dounce Homogenizerで20回ホモジェナイズしても細胞核を破砕できますが、破砕が不完全になる可能性があります。
  8. 9,400​ x gで10分間、4°Cで遠心分離して、ライセートを清澄化してください。
  9. 上清を新しいチューブに移してください。(​​SAFE STOP​) これがクロスリンクしたクロマチン調製液です。使用するまで‐80℃で保存してください。50 μLのクロマチン調製液を、クロマチンの断片化および濃度の解析 (セクションIV) に使用します。このサンプル50 µLは-20℃で一晩保存しても構いません。

IV. クロマチンの断片化および濃度の解析 (推奨ステップ)

  1. クロマチンサンプル 50 μL (セクションIIIのステップ9) に、Nuclease-free water 100 μL、5 M NaCl #7010 6 μL、およびRNAse A #7013 2 μLを加えてください。ボルテックスで混和し、37℃で30分間インキュベートしてください。
  2. RNase Aで処理した各サンプルに、Proteinase K 2 μLを加え、ボルテックスにより混和し、65℃で2時間インキュベートしてください。
  3. セクションVIIに記載されているとおり、DNA精製用スピンカラムを用いてDNAをサンプルから精製してください。(​​SAFE STOP​) DNAは-20℃で6ヵ月まで保存することができます。
  4. DNA精製後、各サンプル10 μLを、100 bpのDNAマーカーとともに1%アガロースゲルで電気泳動し、DNA断片のサイズを測定してください。DNAが約150-900 bp (1-5​個のヌクレオソーム、図1参照) のサイズに断片化されているはずです。
  5. DNA濃度を測定するため、精製したDNA 2 μLをNuclease-free water 98 μLに入れて50倍希釈し、OD260を記録してください。原液のDNA濃度 (μg/mL) は、OD260 x 2,500となります。理想的なDNA濃度は50-200 μg/mLです。

注意：最適なChIPの結果を得るためには、クロマチンのサイズと濃度を適切にすることが非常に重要です。クロマチンを断片化しすぎると、定量PCRのシグナルが消失する可能性があります。一方で、クロマチンの断片化が不十分な場合、バックグラウンドシグナルが上昇し分解能が低下します。また、免疫沈降に用いるクロマチン量が少なすぎると、定量PCRのシグナルが低下する原因になります。クロマチンの断片化を最適化するためのプロトコルは、Appendix Bに記載されています。

V. クロマチン免疫沈降 (ChIP)

最適なChIPの結果を得るため、免疫沈降1回あたり約5-10 μgの断片化されたクロスリンククロマチン (セクションIVに記載) を使用してください。これは、25 mgの破砕した組織あるいは4​ x 106​個の培養細胞から調製された免疫沈降サンプル100 μL分に概ね相当します。一般的には、抗体を加える前にクロマチンサンプル100 μLを1X ChIP Buffer 400 μLで希釈しますが、免疫沈降1回あたり100 μL以上必要な場合は下記のようにクロマチンサンプルを希釈する必要はありません。希釈しない場合も、クロマチンサンプルに直接抗体を加えることでクロマチン複合体の免疫沈降ができます。

実験開始前の準備

(!) すべてのバッファーの量は、免疫沈降の回数に応じて比例的に増やす必要があります。

  • 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012を取り出し、室温に戻してください。PICが完全に溶けていることを必ず確認してください。
  • 10X ChIP Buffer #7008を取り出して室温に戻し、SDSが完全に溶解していることを確かめてください。
  • 断片化したクロマチン調製液 (セクションIIIのステップ9から) を解凍し、氷上で解凍します。
  • Low salt washの調製：免疫沈降1回につき、1X ChIP Buffer (10X ChIP Buffer #7008 300 µL + 水2.7 mL) 3 mL。使用するまで室温で保持してください。
  • High salt washの調製：免疫沈降1回につき、1X ChIP Buffer (10X ChIP Buffer #7008 100 µL + 水900 µL) 1 mL + 5 M NaCl #7010 70 µL。使用するまで室温で保持してください。
  1. 1本のチューブに、予定の免疫沈降回数分の消化クロマチンを調製する希釈操作に十分な量の1X ChIP Bufferを用意します：免疫沈降1回につき、1X ChIP Buffer (10X ChIP Buffer 40 µL + 水360 µL) 400 µL + 200X PIC <ut>2</ut> µL。免疫沈降のサンプル数を決定する時には、ポジティブコントロールのHistone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620およびネガティブコントロールのNormal Rabbit IgG Antibody #2729​​のサンプルを数に含めてください。調製したチューブを氷上に保持してください。
  2. 調製した1X ChIP Bufferへ、断片化とクロスリンクをしたクロマチン調製液 (セクションIIIのステップ9) を免疫沈降1回あたり100 μL (5-10 μgのクロマチンに相当する量) 加えます。例えば、10​回分の免疫沈降では、1X ChIP Buffer 4 mL (10X ChIP Buffer 400 μL + 水3.6 mL) + 200X PIC 20 μL + 断片化したクロマチン調製液1 mLを入れたチューブを1本調製してください。
  3. 希釈したクロマチン10 μLを遠心分離用チューブに移してください。これが2%インプットサンプルです。使用するまで-20℃で保存してください (セクションVIのステップ1で使用します)。
  4. 免疫沈降ごとに、断片化したクロマチン500 μLを1.5 mLの遠心分離用チューブに分注し、免疫沈降用抗体を加えてください。必要な抗体量は免疫沈降ごとに異なりますので、お客様ご自身で決定する必要があります。ポジティブコントロールのHistone H3 (D2B12) XP®​Rabbit mAb #4620については、10 μLを免疫沈降サンプルに加えてください。ネガティブコントロールのNormal Rabbit IgG #2729については、1-2 μL (1-2 μg) を免疫沈降サンプルに加えます*。CST抗体を用いる場合は、データシートまたは製品のウェブページに記載されている希釈率を参照し、対照比較のためにCST抗体の濃度に基づいてネガティブコントロールのIgG抗体の量 (μg) を算出してください。ローテーターを用いて、免疫沈降サンプルを4℃で4時間から一晩インキュベートしてください。

    注意：Cell Signaling Technologyのほとんどの抗体は、免疫沈降1回あたり1-2 µgを使用することで適切にワークします。濃度の異なる複数の抗体がある場合は、最も高い抗体濃度にネガティブコントロールNormal Rabbit IgG #2729の濃度を合わせて使用することをお勧めします。

  5. ChIP Grade Protein G Magnetic Beads #9006を穏やかにボルテックスし、再懸濁してください。直ちにProtein G Magnetic Beads 30 μLをそれぞれの免疫沈降反応液に加え、ローテーターを用いて、4℃で2時間インキュベートしてください。
  6. 各免疫沈降ごとにチューブをMagnetic Separation Rack #7017にセットし、Protein G Magnetic Beadsを分離させてください。溶液が澄むまで1-2分間待ち、上清を注意深く取り除いてください。
  7. low salt wash 1 mLをBeadsに加えてProtein G Magnetic Beadsを洗い、4℃で5分間ローテーターを用いてインキュベートします。ステップ6と7を更に2回繰り返し、計3回low salt washで洗ってください。
  8. high salt wash 1 mLをBeadsに加え、4℃で5分間ローテーターを用いてインキュベートしてください。
  9. 各免疫沈降ごとにチューブをMagnetic Separation Rackにセットし、Protein G Magnetic Beadsを分離させてください。溶液が澄むまで1-2分間待ち、上清を注意深く取り除いてください。直ちにセクションVIに進んでください。

VI. 抗体/Protein G Magnetic Beadsからのクロマチンの溶出および脱クロスリンク

実験開始前の準備

(!) すべてのバッファーの量は、免疫沈降の回数に応じて比例的に増やす必要があります。

  • 37℃のウォーターバスで2X ChIP Elution Buffer #7009を温め、SDSが完全に溶解していることを確認してください。
  • 水浴またはサーモミキサーを65℃に設定してください。
  • 各免疫沈降サンプルおよび2%インプットサンプルごとに、1X ChIP Elution Buffer 150 μL (2X ChIP Elution Buffer #7009 75 μL+ 水75 μL) を用意してください。
  1. 1X ChIP Elution Buffer 150 μLを、2%インプットサンプル入りのチューブに加え、ステップ6で使用するまで室温に置いておきます。
  2. 1X ChIP Elution Buffer 150 μLを、それぞれの免疫沈降サンプルに加えてください。
  3. 静かにボルテックス (1,200 rpm) しながら、65℃で30分間処理し、抗体/Protein G Magnetic Beads複合体からクロマチンを溶出してください。本ステップには、サーモミキサーの使用をお勧めします。代わりにローテーターを用いて室温で溶出することもできますが、完全に溶出されない可能性があります。
  4. チューブをMagnetic Separation Rackにセットし、液が澄むまで1-2分間待ち、Protein G Magnetic Beadsを分離させてください。
  5. 溶出されたクロマチンを含む上清を、注意深く新しいチューブに移してください。
  6. ステップ1で調製した2%インプットサンプルを含むすべてのチューブに、5M NaCl 6 μLおよびProteinase K #10012​ 2 μLを加えて65℃で2時間インキュベートし、脱クロスリンクしてください。インキュベーションは一晩まで延長することができます。
  7. 直ちにセクションVIIに進んでください。(​​SAFE sTOP​) もしくは、サンプルは-20℃で4​日間まで保存できます。ただし、沈殿物の形成を防ぐために、DNA Binding Buffer #10007を加える前に (セクションVIIのステップ1)、必ずサンプルを室温に戻してください。

VII. スピンカラムを用いたDNAの精製

実験開始前の準備

  • (!!) 使用前に、エタノール (96 - 100%) 24 mLをDNA Wash Buffer #10008​​に加えてください。このステップは、DNA精製の最初のセッティングの前に1度だけ実施してください。
  • セクションVで得られた各DNAサンプルに対し、DNA Purification collection tube #10010​​を一つずつ用意してください。
  1. DNA Binding Buffer #10007​ 750 μLを各DNAサンプルに加え、軽くボルテックスしてください。
    • 1サンプルあたり5倍量のDNA Binding Bufferを使用します。
  2. ステップ1のサンプル450 μLを、コレクションチューブにセットしたDNAスピンカラムに移してください。
  3. 18,500​ x gで30秒間遠心分離してください。
  4. コレクションチューブからスピンカラムを取り外し、液体を廃棄してください。スピンカラムをコレクションチューブに再セットしてください。
  5. ステップ1で残った各サンプル450 μLを、コレクションチューブにセットしたスピンカラムに移してください。ステップ3と4を繰り返してください。
  6. DNA Wash Buffer #10008 750 μLを、コレクションチューブにセットしたスピンカラムに加えてください。
  7. 18,500​ x gで30秒間遠心分離してください。
  8. コレクションチューブからスピンカラムを取り外し、液体を廃棄してください。スピンカラムをコレクションチューブに再セットしてください。
  9. 18,500​ x gで30秒間遠心分離してください。
  10. コレクションチューブと液体を廃棄してください。スピンカラムは廃棄しないでください。
  11. DNA Elution Buffer #10009 50 μLを各スピンカラムに加え、新しい1.5 mLの遠心分離用チューブにセットしてください。
  12. 18,000​ x gで30秒間遠心分離して、DNAを溶出してください。
  13. DNAスピンカラムを取り外し、廃棄してください。得られた溶出液が精製されたDNAです。(​​SAFE STOP​) サンプルは-20℃で保存することができます。

VIII. PCRによるDNAの定量

推奨される対処法

  • コンタミネーションを防ぐため、ピペットチップはフィルター付きのものを使用してください。
  • キットに含まれているコントロールプライマーは、ヒトとマウスのRPL30遺伝子 (#7014​と#7015) に特異的で、通常のPCRまたは定量的リアルタイムPCRのどちらにも使用することができます。他の動物種でChIPを実施する場合は、その種で使用可能な適切なプライマーを設計し、最適なPCR条件を決定してください。
  • 非特異的なPCR産物の増幅を防ぐため、ホットスタート用Taqポリメラーゼの使用を推奨します。
  • プライマーの設定は非常に重要です。以下の条件に近いプライマーを設計してください:
プライマーの長さ： 24塩基
Tm： 60°C
GC： 50%
アンプリコンのサイズ： 150-200 bp (通常のPCR)
80-160 bp (定量的リアルタイムPCR)

通常のPCR：

  1. 0.2 mLのPCRチューブに適切な番号をラベルしてください。2%インプットサンプル、ポジティブコントロールのHistone H3サンプル、ネガティブコントロールのNormal Rabbit IgGサンプル、およびDNAコンタミネーションに対するコントロールとしてDNAなしのチューブを用意してください。
  2. 各チューブにDNAサンプル2 μLを分注してください。
  3. 分量不足を防ぐために、実際のチューブの本数に2本追加した量を全体量として、マスターミックスを下記の通りに調製してください。各反応用チューブにマスターミックス18 μLを加えてください。
試薬 PCR反応1回分の分量 (18 μL)
Nuclease-free H2O 12.5 µL
10X PCR Buffer 2.0 µL
4 mM dNTP Mix 1.0 µL
5 µM RPL30 プライマー 2.0 µL
Taq DNA Polymerase 0.5 µL
  1. PCR反応を以下のプログラムで開始してください：
a. 初期変性 95℃ 5分間
b. 変性 95℃ 30 秒間
c. アニーリング 62℃ 30 秒間
d. 伸長反応 72℃ 30 秒間
e. ステップb-dを繰り返し、計34サイクル反応させてください。
f. 最終伸長反応 72℃ 5分間
  1. 反応終了後、100 bpのDNAマーカーとともに、各PCR産物10 μLを2%アガロースゲルまたは10%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動してください。予想されるPCR産物のサイズは、Human RPL30 #7014では161 bp、Mouse RPL30 #7015では159 bpです。

定量的リアルタイムPCR：

  1. 使用するPCR装置のモデルに対応するPCRチューブあるいはPCRプレートに、適切なサンプル番号を記載してください。PCR反応には、ポジティブコントロールのHistone H3サンプル、ネガティブコントロールのNormal Rabbit IgGサンプル、DNAコンタミネーション確認用のコントロールとしてDNAを含まないチューブ、および標準曲線の作成と増幅効率の決定のため2%インプットクロマチンDNAの段階希釈サンプル (希釈なし、1：5、1：25、1：125) を用意してください。
  2. PCRチューブあるいはPCRプレートのウェルに、適切なDNAサンプル2 μLを加えてください。
  3. 以下のように、マスターミックスを調製してください。分量不足を考慮して、実際のチューブの本数に2本追加した量を全体量として、調製してください。各PCRチューブあるいは各ウェルにマスターミックス18 μLを加えてください。(​​SAFE STOP​) 必要に応じて、遮光のためアルミホイルでプレートを覆い、4℃の場合は4時間まで、また-20℃の場合は一晩、装置が使用できるようになるまで保存してください。
試薬 PCR反応1回分の分量 (18 μL)
Nuclease-free H2O 6 µL
5 µM RPL30 プライマー 2 µL
SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 10 µL
  1. PCR反応を以下のプログラムで開始してください：
a. 初期変性 95℃ 3分間
b. 変性 95℃ 15秒間
c. アニーリングおよび伸長： 60℃ 60秒間
d. ステップb - cの繰り返し (合計40サイクル)

  1. リアルタイムPCR装置に付属のソフトウェアを使用して、定量結果を解析してください。代替法として、Percent Input法により下記の公式を用いて、免疫沈降の効率を算出することもできます。この方法では、各免疫沈降で回収されたシグナルを、インプットクロマチン総量の割合 (%) で示します。

    Percent Input = 2% x 2(C[T] 2%Input Sample - C[T] IP Sample)

    C[T] = CT= PCR反応の閾値となるサイクル

IX. NG-seqライブラリーの調製

本キットを用いて調製したDNAサンプルは、直接ChIP-seqに使用できます。NG-シークエンスDNAライブラリーの構築は、採用予定のシーケンスプラットフォームと互換性のあるDNAライブラリー調製プロトコールまたはキットを使用して行ってください。Illumina®​プラットフォームでのシーケンシングの場合、DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795と、関連するインデックスプライマーMultiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580もしくは、Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538の使用を推奨します。

推奨事項：

  • 転写因子またはコファクターのChIP-seqでは、ChIPで濃縮したDNAを少なくとも5 ng使用し、10サイクルのPCRでアダプター配列が結合したDNAを増幅してください。
  • Totalヒストン、ヒストン修飾、そしてインプットサンプルについては、ChIPで濃縮したDNA 50 ngを使用するところから始め、6サイクルのPCRでアダプター配列が結合したDNAを増幅してください。
  • どんなターゲットの種類に対しても、ChIPで濃縮したDNAのライブラリー構築でサイズセレクションを行わずに、アダプター配列が結合したDNAをクリーンナップしてください。
  • DNAライブラリー構築後、Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Cat# G2938-90322)、または2%アガロースTAEゲルを用いて50-100 ngのDNAを電気泳動し、アダプターダイマー (約140 bp) がDNAライブラリーに存在するかどうかを確認してください。アダプターダイマーがDNAライブラリーに存在する場合は、PCR増幅産物のクリーンアップを繰り返してください。
  • ライブラリーの品質は、既知のポジティブおよびネガティブコントロール用プライマーセットを用いたリアルタイムPCRにより確認することもできます。オリジナルのChIP産物を用いた結果と同様に、DNAライブラリーでもポジティブコントロールはネガティブコントロールと比較して高いシグナルが得られるはずです。
  • 最終的なクリーンアップおよび品質チェックの後、最終精製ライブラリーサンプルを2 - 10 nMに調製してハイスループットシーケンシングに使用してください。

APPENDIX A：予想されるクロマチン収量

組織サンプルからクロスリンククロマチンを調製する場合、組織の種類によってクロマチン収量が大きく異なります。右の表には、4 x 106個のHeLa細胞の場合と比較しながら、25 mgの組織から調製した場合に予想されるクロマチン収量と、予想されるDNA濃度を示しています。これらは、プロトコールのセクションIVに記載した方法で決定しています。各組織において、Medimachine (BD Biosciences) またはDounce Homogenizerのどちらを用いてホモジナイズした場合もクロマチン収量はほぼ同じでした。ただし、多くの場合、Medimachineを用いて破砕した組織から得たクロマチンは、Dounce Homogenizerを用いた場合よりも免疫沈降効率が高くなりました。脳組織サンプルに関しては、Medimachineでは単細胞懸濁液になるまで十分に破砕することができないため、Dounce Homogenizerを使用してください。最適なChIPの結果を得るためには、免疫沈降1回あたり5-10 µgの断片化したクロスリンククロマチンの使用をお勧めします。組織によっては、免疫沈降1回に必要な組織量が25 mgを超えることがあります。

組織/細胞 総クロマチン収量 予想されるDNA濃度
脾臓 25 mgの組織に対し20-30 µg 200 - 300 µg/mL
肝臓 25 mgの組織に対し10-15 µg 100 - 150 µg/mL
腎臓 25 mgの組織に対し8-10 µg 80 - 100 µg/mL
脳 25 mgの組織に対し2-5 µg 20 - 50 µg/mL
心臓 25 mgの組織に対し2-5 µg 20 - 50 µg/mL
HeLa 4 x 106個の細胞に対し10-15 µg 100 - 150 µg/mL

APPENDIX B：クロマチン断片化の最適化

クロスリンクしたクロマチンDNAを150-900 bpの長さに断片化する場合の最適条件は、断片化に用いる組織量または細胞数に対するMicrococcal Nucleaseの比率に大きく依存します。特定の組織または細胞タイプで、クロマチンの断片化の至適条件を決定するプロトコールを以下に示します。

  1. プロトコールのセクションI、II、IIIに記載の通り、125 mgの組織または2 × 107個の細胞 (5回分の免疫沈降に相当) を用いて、クロスリンクした細胞核を調製してください。セクションIIIのステップ2を行った後、下記に進んでください。
  2. 細胞核サンプルを100 μLずつ1.5 mLの遠心分離用チューブ5本に分注し、氷上に置いてください。
  3. Micrococcal Nuclease 3 μLを1X Buffer B + DTT混合液27 μLに加えてください (酵素を10倍に希釈します)。
  4. 希釈したMicrococcal Nuclease 0 μL、2.5 μL、5 μL、7.5 μL、10 μLを、ステップ2で用意した5本の各チューブに加え、チューブを数回転倒混和し、頻繁に撹拌しながら37℃で20分間インキュベートしてください。
  5. 10 M EDTA 0.5 μLを加えることで断片化を停止し、チューブを氷上に置いてください。
  6. 16,000​ x gで1分間、4℃で遠心分離して細胞核を沈殿させ、上清を除去してください。
  7. 細胞核を1X ChIP Buffer + PIC混合液200 μLに再懸濁してください。氷上で10分間インキュベートしてください。
  8. ライセートを数回ソニケーション処理し、核膜を破砕してください。ソニケーション処理の合間に、サンプルを30秒間氷水に浸してインキュベートしてください。細胞核を完全に溶解するために必要な最適条件は、ソニケーション処理の前後に細胞核を光学顕微鏡で観察することで決定できます。VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator (1/8-inch probe) を6に設定し、20秒間のソニケーション処理を3回行うことで、HeLa細胞核は完全に溶解されます。代わりに、Dounce Homogenizerで20回ホモジェナイズしても細胞核を破砕できますが、破砕が不完全になる可能性があります。
  9. 9,400​ x gで10分間、4°Cで遠心分離して、ライセートを清澄化してください。
  10. ソニケーション処理した各ライセート50 μLを新しい遠心分離用チューブに移してください。
  11. 各サンプル50 μLに、ヌクレアーゼフリー水100 μL、5M NaCl 6 μL、RNase A 2 μLを加え、ボルテックスにより混和し、37℃で30分間インキュベートしてください。
  12. RNase Aで処理した各サンプルに、Proteinase K 2 μLを加え、ボルテックスにより混和し、65℃で2時間インキュベートしてください。
  13. 各サンプル20 μLを、100 bp DNAマーカーとともに1%アガロースゲルで電気泳動し、DNA断片のサイズを確認してください。
  14. 得られたDNAが150-900 bp (1-5個のヌクレオソームに相当) の範囲になる断片化条件を確認してください。この最適化プロトコールを用いて検討した目的サイズのDNA断片を生じる希釈したMicrococcal Nucleaseの量は、目的サイズのDNA断片を生じる1回分の免疫沈降サンプル (破砕した組織25 mgまたは4​ x 106個の培養細胞) に加えられるMicrococcal Nuclease原液の10倍量に相当します。例えば、本プロトコールで希釈したMicrococcal Nuclease 5 μLにより150-900 bpのDNA断片が生じた場合、セクションIIでクロマチンを断片化する際には1回のIP prepにつき0.5 μLのMicrococcal Nuclease原液を加えることになります。
  15. 目的サイズのDNAが得られなかった場合は、サンプル毎にMicrococcal Nuclease量を調整しながら、本最適化プロトコールを繰り返してください。もしくは、断片化時間を調整することでDNA断片化のサイズを最適化することができます。

APPENDIX C：トラブルシューティングガイド

問題 考えられる原因 推奨される対処法
1. 断片化されたクロマチンの濃度が低すぎる。 細胞数が不十分、あるいは断片化後の細胞核の破砕が不完全。

クロマチンサンプルのDNA濃度が50 μg/mLに近い場合は、1回の免疫沈降あたり少なくとも5 μgとなるようにクロマチン調製液を追加して、プロトコールに従って実験を続けてください。

クロスリンクの前に、カウント用に別に用意したディッシュで細胞数を計測し、正確な細胞数を確認してください。さらに、顕微鏡下でソニケーション前後の細胞核を観察し、核の完全な破砕を確認してください。
2. クロマチンの断片化が不十分で、断片が大きすぎる (900 bpを超える)。

細胞のクロスリンクが過剰。10分間以上クロスリンクを行うと、クロマチンの断片化を阻害する可能性がある。

細胞数が多すぎる、またはMicrococcal Nuclease量が足りない。

ホルムアルデヒド濃度を一定にして、時間経過に伴う変化を確認してください。クロスリンク時間を10分以下に短縮してください。

クロスリンクの前に別に用意したプレートの細胞数を計測し、Appendix Bを参照してクロマチンの断片化条件を最適化します。
3. クロマチンが過剰に断片化され、DNA断片のサイズが小さすぎる (150 bpのモノヌクレオソーム1個分の断片ばかりが検出される)。ヌクレオソーム1個分のDNAの長さになるまでクロマチンを完全に断片化すると、特に長さが150 bp以上のアンプリコンの場合、PCRでシグナルが減弱する可能性がある。 クロマチン断片化に加えた細胞数が不十分、またはMicrococcal Nuclease量が多すぎる。 クロスリンクの前に別に用意したプレートの細胞数を計測し、Appendix Bを参照してクロマチンの断片化条件を最適化します。
4. インプットDNAのPCR反応で産物が得られない、または得られる量が非常に少ない。

PCR反応に使用したDNA量が十分でない、またはPCR条件が最適でない。

PCRの増幅領域が、ヌクレオソームフリー領域に及んでいる。

IPに加えたクロマチンが十分でない、またはクロマチンの断片化が過剰。

PCR反応により多くのDNAを使用するか、サイクル数を増加させてください。

クロスリンク後に断片化したクロマチンから精製したDNAを用いて、プライマーセットに対する最適なPCR条件を検討してください。アンプリコンの長さが150 bp以下になるように、別のプライマーセットを設計してください (セクションIIIのプライマー設計に関する推奨事項を参照してください)。

最適なChIP結果を得るために、免疫沈降1回あたりクロマチン5-10 μgを加えてください。上記1、3の対応策も参照してください。
5. ポジティブコントロールであるHistone H3抗体の免疫沈降サンプルとRPL30プライマーを用いたPCR反応で増幅が起こらない。

免疫沈降に加えたクロマチンまたは抗体が十分でない、または免疫沈降のインキュベーション時間が短すぎる。

Protein G Beadsからのクロマチンの溶出が不十分である。

各免疫沈降反応にクロマチン5-10 μgと抗体10 μLを加えたことを確認して一晩インキュベートし、Protein G Beadsを加えてさらに2時間インキュベートしてください

Protein G Beadsからのクロマチンの溶出には65℃が最適です。頻繁に撹拌してBeadsの懸濁状態を保ってください。
6. ネガティブコントロールのRabbit IgGの免疫沈降産物と、ポジティブコントロールのHistone H3抗体の免疫沈降産物で、PCRでの増幅が同程度になる。

免疫沈降に使用したクロマチン量が過剰、または十分でない。あるいは、免疫沈降に抗体を加えすぎている。

PCR反応に加えたDNAが多すぎる、またはサイクル数が多すぎる。

各免疫沈降反応に対して加える量は、クロマチン15 μg、Histone H3 antibody 10 μLを上限としてください。Normal rabbit IgG量を一回のIPあたり1 μLまで減らしてください。

PCR反応に加えるDNAを減らすか、PCRのサイクル数を減らしてください。PCRの線形増幅領域内でPCR産物を解析することが非常に重要です。そうしなければ、増幅前のDNA量の差が正確に測定できません。
7. 解析したいターゲットの抗体の免疫沈降産物で、PCR反応による増幅が起こらない。

PCR反応に加えたDNA量が十分でない。

免疫沈降に使用した抗体量が十分でない。

免疫沈降ではワークしない抗体である。

PCR反応により多くのDNAを使用するか、サイクル数を増加させてください。

通常は抗体1-5 μgを免疫沈降に加えます。しかし、実際に必要な量は抗体によって大きく異なります。

免疫沈降反応液に加える抗体の量を増やしてください。別の抗体を検討してください。

更新：2011年12月

改訂日：2022年4月

Protocol Id: 82

特異性 / 感度

Nanog Antibody detects endogenous levels of total nanog protein.

種交差性:

ヒト

使用抗原 / 精製方法

Polyclonal antibodies are produced by immunizing animals with a synthetic peptide corresponding to amino acid sequence at the N-terminus of human nanog. Antibodies are purified by Protein A and peptide affinity chromatography.

バックグラウンド

Nanog is a homeodomain-containing transcription factor that is essential for the maintenance of pluripotency and self renewal in embryonic stem cells (1). Nanog expression is controlled by a network of factors including Sox2 and the key pluripotency regulator Oct-4 (1). Recent advances in somatic cell reprogramming have utilized viral expression of combinations of transcription factors including nanog, Oct-4, Sox2, KLF4, c-Myc, and LIN28 (2,3).

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