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70174
α-Adducin (D7T7R) Rabbit mAb
一次抗体
モノクローナル抗体

α-Adducin (D7T7R) Rabbit mAb #70174

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Western blot analysis of exracts from LN18, HT-29, and U-2 OS cells using α-Adducin (D7T7R) Rabbit mAb.

Immunoprecipitation of α-adducin from U-2 OS cell extracts. Lane 1 is 10% input, lane 2 is Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900, and lane 3 is α-Adducin (D7T7R) Rabbit mAb. Western blot analysis was performed using α-Adducin (D7T7R) Rabbit mAb.

To Purchase # 70174S
製品番号 サイズ 価格 在庫
70174S
100 µl

Supporting Data

REACTIVITY H Mk
SENSITIVITY Endogenous
MW (kDa) 120
Source/Isotype Rabbit IgG

Application Key:

  • W-Western
  • IP-Immunoprecipitation
  • IHC-Immunohistochemistry
  • ChIP-Chromatin Immunoprecipitation
  • IF-Immunofluorescence
  • F-Flow Cytometry
  • E-P-ELISA-Peptide

Species Cross-Reactivity Key:

  • H-Human
  • M-Mouse
  • R-Rat
  • Hm-Hamster
  • Mk-Monkey
  • Mi-Mink
  • C-Chicken
  • Dm-D. melanogaster
  • X-Xenopus
  • Z-Zebrafish
  • B-Bovine
  • Dg-Dog
  • Pg-Pig
  • Sc-S. cerevisiae
  • Ce-C. elegans
  • Hr-Horse
  • All-All Species Expected

製品概要

アプリケーション 希釈率
ウェスタンブロッティング 1:1000
免疫沈降 1:50

保存

Supplied in 10 mM sodium HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 100 µg/ml BSA, 50% glycerol and less than 0.02% sodium azide. Store at –20°C. Do not aliquot the antibody.

プロトコール

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ウェスタンブロッティング (WB) プロトコール

ウェスタンブロットでは、転写膜と希釈した一次抗体を静かに振盪しながら、4℃で一晩反応させてください。一次抗体の希釈液として、5% (w/v) BSAおよび0.1% Tween®20​を含む1X TBSを使用してください。

注意:抗体の推奨希釈率については、各製品のデータシートまたはウェブの製品ページを参照してください。

A. 溶液および試薬

サンプル調製から検出まで、ウェスタンブロットに必要な全ての試薬が一つの便利なキット、Western Blotting Application Solutions Kit #12957になりました。

注意​:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS) (#9808):1X PBSを1 L調製する場合は、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  2. 10X Tris Buffered Saline (TBS) (#12498):1X TBSを1 L調製する場合は、10X TBS 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  3. 1X SDSサンプルバッファー (Blue Loading Pack (#7722) またはRed Loading Pack (#7723)):3X SDSローディングバッファーに、1/10量の30X DTTを加え、新しい3X 還元用ローディングバッファーを調製してください。精製水 (dH2O) で1X に希釈してください。
  4. 10X Tris-Glycine SDS Running Buffer (#4050):1X Running Bufferを1 L調製する場合、10X Running Buffer 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  5. 10X Tris-Glycine Transfer Buffer (#12539):1X Transfer Bufferを1 L調製する場合、10X Transfer Buffer 100 mLをメタノール200 mL + 精製水 (dH2O) 700 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  6. 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)​ (#9997):1X TBST を1 L調製する場合、10X TBST 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  7. Nonfat Dry Milk (脱脂粉乳) (#9999)
  8. ブロッキングバッファー:5% w/v 脱脂粉乳含有1X TBST;150 mlLを調製する場合は、脱脂粉乳7.5 gを1X TBST 150 mLに加えてよく混ぜ合わせ、完全に溶解してください。
  9. 洗浄バッファー:1X TBST;10xTBST (#9997) を精製水で10倍希釈してください (上記6をご参照ください)。
  10. ウシ血清アルブミン (BSA) (#9998)
  11. 一次抗体希釈バッファー:5% BSA含有1X TBST;20 mLを調製する場合は、BSA 1.0 gを1X TBST 20 mLに加えてよく混ぜ合わせ、完全に溶解してください。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack (#7727)
  13. ​Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa) (#13953)
  14. 転写膜 (#12369):このプロトコールはニトロセルロース膜を用いて最適化されています。ポアサイズは0.2 µmをお勧めしています。
  15. HRP標識二次抗体:Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074)
  16. 検出試薬:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)

B. タンパク質のブロッティング

最も汎用的なサンプル調製プロトコール

  1. 目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 培養ディッシュから培地を吸引除去し、細胞を1X PBSで洗った後、再度吸引除去してください。
  3. 1X SDSサンプルバッファーを加え (6ウェルプレートは100 µL/ウェル、直径10 cmプレートは500 µL/プレート)、細胞を溶解してください。直ちにプレートから細胞を掻き取り、抽出物を遠心分離チューブに移してください。氷上に保持してください。
  4. 10-15秒間超音波処理してください。この処理には、細胞を完全に溶解する目的と、DNAを剪断してサンプルの粘性を下げる目的があります。
  5. サンプル20 µLを95-100℃で5分間加熱処理後、氷上で冷却してください。
  6. 5分間遠心分離してください。
  7. SDS-PAGEゲル (10 cm × 10 cm) に20 µLをアプライし、電気泳動してください。

    注意:転写確認用のPrestained Protein Marker (#13953、5 µl/lane) および分子量確認用のBiotinylated Protein Ladder (#7727、10 µL/lane) も同時に電気泳動することをお勧めしています。

  8. ニトロセルロース膜 (#12369) に転写してください。

C. 転写膜のブロッキングと抗体反応

注意:10 cm x 10 cm (100 cm2) の転写膜用の容量を記載しています。サイズの異なる転写膜をご使用の際は、適宜容量を調節してください。

I. 転写膜のブロッキング

  1. オプション:転写後、転写膜を室温で5分間、TBS 25 mLで洗ってください。
  2. 転写膜を室温で1時間、ブロッキングバッファー25 mL中でインキュベートしてください。
  3. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。

II. 一次抗体反応

  1. 一次抗体液10 mL (製品のデータシートに記載されている希釈バッファー、希釈率をもとに適切に調製してください) 中で転写膜を静かに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  3. ビオチン化プロテインマーカーを検出するため、Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074、1:2000希釈) およびAnti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075、1:1000–1:3000希釈) を含むブロッキングバッファー10 mL中で転写膜を静かに振盪しながら、室温で1時間インキュベートしてください。
  4. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  5. 検出操作へ進んでください (セクションD)。

D. タンパク質の検出

使用法:

  1. 転写膜に結合したHRP (抗体標識) を、TBSTで5分間、3回洗ってください。
  2. 2X Reagent Aと2X Reagent Bを等量ずつ混ぜ合わせ、1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883) を調製してください。例えば、10 mLを調製する場合は、Reagent A 5 mLをReagent B 5 mLに加えてください。よく混ぜ合わせてください。
  3. 基質を転写膜を1分間インキュベートし、過剰な溶液を取り除き (転写膜を乾燥させないようにご注意ください) 、ラップで覆ってX線フィルムで露光してください。

* 肌に対して繰り返し露光することは避けてください。

更新:2005年6月

改訂日:2013年11月

ウェスタンブロットリプロービングプロトコール

既存の膜のリプロービングは、サンプル量が限られている場合、複数のタンパク質を独立してイムノブロットする便利な手法です。最高の結果を得るためには、リプロービングは避け、常に新しくブロッティングを行うことを推奨します。リプロービングは価値ある方法ですが、ブロットをリプロービングするごとに、バックグランドシグナルが増す可能性があります。また、リプロービング前にまず抗体複合体が除去されていることを確認し、新しい抗体の結合によるシグナルが、最初の免疫沈降実験の残りのシグナルではないことを確認してください。これは、このブロットをECL試薬で再露光し、次の一次抗体を追加する前にシグナルがないことを確かめることで、確認できます。

A. 溶液および試薬

注意:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水または同等の精製水で調製してください。

  1. ​洗浄バッファー:​Tris Buffered Saline with Tween® 20; 10X TBST (#9997) を精製水で10倍希釈してください。
  2. ストリッピングバッファー:100 mLを調製する場合は、1M Tris-HCl (pH 6.8​) 6.25 mL、20% SDS 10 mL、βメルカプトエタノール700 μLを混ぜ合わせてください。精製水 (dH20) で100 mLにしてください。使用直前に新しいバッファーを調製してください。

B. プロトコール

  1. フィルム露光後、転写膜をTBSTで各5分間、4回洗ってください。最良の結果を得るために、転写膜は乾かさないようにしてください。
  2. 転写膜をストリッピングバッファー中で緩やかに振盪しながら、50°Cで30分間インキュベートしてください。
  3. 転写膜をTBSTで各5分間、6回洗ってください。
  4. オプション:最初のシグナルを確実に除去するために、転写膜をTBST 10 mLで5分間、2回洗ってください。転写膜をLumiGLO®で穏やかに振盪しながら、室温で1分間インキュベートしてください。転写膜の過剰な液を除去してください。乾かさないでください。ラップで包んで、X線フィルムに露光してください。
  5. 再度転写膜をTBSTで各5分間、4回洗ってください。
  6. 転写膜の再利用の準備が整いました。ウェスタンブロッティングプロトコールの「I. 転写膜のブロッキング」と「II.抗体のインキュベーション」の手順に従って、検出を開始してください。

更新:2005年6月

改訂日:2016年10月

Protocol Id: 10

未変性タンパク質の免疫沈降

このプロトコールには、Protein A磁気分離による未変性タンパク質の免疫沈降の手順が記載されています。この手順で得られたサンプルは、ウェスタンブロッティングやキナーゼ活性による解析にご使用いただけます。

A. 溶液および試薬

注意​:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS) ​(#9808):1X PBSを1 Lを調製する場合は、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  2. 10X Cell Lysis Buffer (#9803):1X Cell Lysis Bufferを10 mL調製する場合は、10X Cell Lysis Buffer 1 mLを精製水 (dH2O) 9 mlに加え、混ぜ合わせてください。

    注意:使用直前に1 mM PMSF (#8553) を加えてください

  3. 3X SDS Sample Buffer (Blue Loading Pack (#7722) またはRed Loading Pack (#7723)):3X SDSローディングバッファーに1/10​量の30X DTTを加え、新しい3X 還元用ローディングバッファーを調製してください。
  4. Protein A Magnetic Beads (#73778)
  5. Magnetic Separation Rack (#7017または#14654)
  6. 10X Kinase Buffer (キナーゼアッセイ用) (#9802):1X Kinase Bufferを1 mL調製する場合は、10X Kinase Buffer 100 µLを精製水 (dH2O) 900 µLに加えて、混ぜ合わせてください。
  7. ATP (10 mM) (キナーゼアッセイ用) (#9804):ATP (200 µM) を0.5 mL調製する場合は、ATP (10 mM) 10 µLを1X Kinase Buffer 490µLに加えてください。

B. 細胞ライセートの調製

  1. 培地を吸引してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 未変性状態で細胞を採取するために、培地を除去し、氷冷した1X PBSで細胞を1回洗ってください。
  3. PBSを除去し、各プレート (10 cm) に氷冷した1X Cell Lysis Buffer 0.5 mLを加え、氷上で5分間インキュベートしてください。
  4. プレートから細胞を掻き取り、遠心分離用チューブに移してください。氷上に保持してください。
  5. 氷上で超音波処理を3回 (各5秒間) 行なってください。
  6. 4°C、14,000​ x gで10分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。必要に応じて、ライセートは-80°Cで保存することができます。

C. 免疫沈降

細胞ライセートのプレクリア (オプション)

Protein A Magnetic Beadsへのタンパク質の非特異的結合を低減させるために、細胞ライセートのプレクリアステップを強くお勧めします。テストサンプルとアイソタイプコントロールを用意するのに十分な量のライセートをプレクリア処理してください。

  1. 磁気ビーズのストックチューブを手早くボルテックスし、再懸濁してください。

    重要:使用直前に Magnetic Beads #73778を前洗浄してください (ステップ2)

  2. ビーズスラリー20 μLを新しいチューブに移してください。チューブを磁気分離ラックに10-15 秒間設置してください。

    溶液が澄んだらバッファーを注意深く除去してください。1X Cell Lysis Buffer 500 μLを磁気ビーズペレットに加え、手早くボルテックスしてビーズを洗ってください。チューブを磁気分離ラックに戻してください。溶液が澄んだらバッファーを除去してください。もう一度、洗いの操作を繰り返してください。

  3. 細胞ライセート200 μLを前洗浄した磁気ビーズ20 μLに加えてください。

    重要:ライセートの至適濃度は、標的タンパク質の発現レベルによって異なります。開始濃度として、250 μg/mL-1.0 mg/mLをお勧めします。

  4. ローテーターを用いて、室温で20分間インキュベートしてください。
  5. 磁気分離ラックを使用して、ビーズをライセートから分離し、プレクリアされたライセートを新しいチューブに移して、磁気ビーズペレットを捨ててください。
  6. 免疫沈降セクションへと進んでください。

免疫沈降

重要:免疫沈降での一次抗体の特異的な結合を確認するために、適切なアイソタイプコントロールの使用を強くお勧めします。ラビットポリクローナル一次抗体にはNormal Rabbit IgG #2729、ラビットモノクローナル一次抗体にはRabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900、マウスモノクローナル一次抗体にはMouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415を使用してください。同一濃度のアイソタイプコントロールを用い、また、一次抗体のサンプルと並行してプロトコールを進める必要があります。

  1. 製品データシートに記載されている推奨希釈率に従い、一次抗体を、細胞ライセート 200 µLに加えてください。ローテーターを用いて、4°Cで一晩インキュベートし、免疫複合体を形成させてください。
  2. 予め磁気ビーズを前洗浄してください (細胞ライセートのプレクリアセクション、ステップ1と2を参照してください)。
  3. ライセートと抗体 (免疫複合体) を含む溶液を、前洗浄した磁気ビーズぺレットを入れたチューブに移してください。
  4. ローテーターを用いて、室温で20分間インキュベートしてください。
  5. 磁気分離ラックを使用してビーズを分離してください。ペレットを1X Cell Lysis Buffer 500 µLで5回洗ってください。洗いの操作は氷上で行ってください。
  6. ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼ活性分析 (セクション D) で解析してください。

D. サンプルの解析

以下のステップから適切な操作に進んでください。

ウェスタンブロッティングで解析する場合

  1. ペレットを3X SDSサンプルバッファー20-40 μLで再懸濁し、手早くボルテックスして混ぜ合わせ、手早く遠心分離してサンプルを沈殿させてください。
  2. サンプルを95-100°Cで5分間加熱してください。
  3. 磁気分離ラックを使用してビーズを分離してください。上清を新しいチューブに移してください。上清がサンプルです。
  4. サンプルをウェスタンブロット解析してください (ウェスタンブロッティングプロトコールをご覧ください)。

注意:免疫沈降に用いた一次抗体がウェスタンブロットで検出されることがあります。変性IgG重鎖 (およそ50 kDa) によって起こるマスキングを最小化するには、Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) またはMouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (またはHRP conjugate #5127) の使用を推奨します。変性IgG軽鎖 (およそ25 kDa) によって起こるマスキングを最小化する場合は、Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (またはHRP conjugate #5127) の使用を推奨します。

キナーゼアッセイで解析する場合

  1. ペレットを1X Kinase Buffer 500 µLで2回洗ってください。氷上に保持してください。
  2. 200 µM ATPと適切な基質を添加した1X Kinase Buffer 40 µLでペレットを懸濁してください。
  3. 30°Cで30分間インキュベートしてください。
  4. 3X SDSサンプルバッファー20 µLで反応を停止させます。ボルテックスした後、30秒間遠心分離してください。
  5. リン酸化基質を含む上清を、新しいチューブに移して下さい。
  6. サンプルを95-100°Cで2-5分間加熱し、14,000 x gで1分間遠心分離してください。
  7. サンプル (15-30 µL) をSDS-PAGEゲルにロードしてください。

更新:2008年12月

改訂日:2018年4月

Protocol Id: 410

特異性 / 感度

α-Adducin (D7T7R) Rabbit mAb recognizes endogenous levels of total α-adducin protein.

Species Reactivity:

ヒト, Monkey

使用抗原 / 精製方法

Monoclonal antibody is produced by immunizing animals with a synthetic peptide corresponding to residues surrounding Asp643 of human α-adducin protein.

バックグラウンド

The adducins (ADD) are cytoskeleton-associated proteins that help cap the ends of actin filaments, promote association between spectrin and actin, and participate in synapse assembly. The three closely related genes ADD1, ADD2, and ADD3 encode the α-adducin, β-adducin, and γ-adducin proteins (1). Research studies indicate that β-adducin is found at high levels in brain and hematopoietic tissues, whereas both α-adducin and γ-adducin are ubiquitously expressed (2). Adducin protein function is regulated by phosphorylation at a number of sites. Both PKA and PKC can phosphorylate α-adducin at Ser726 and β-adducin at Ser713, which inhibits calmodulin binding and adducin activity (3-5). Additionally, PKA (but not PKC) can phosphorylate β-adducin at Ser408, Ser436, and Ser481, which negatively affects spectrin-actin interactions (3). Phosphorylation of α-adducin at Thr445 and Thr480 by Rho-kinase regulates cell motility and membrane ruffling (6). Finally, CDK-1 phosphorylation of α-adducin at Ser12 and Ser355 during mitosis leads to association of α-adducin with the mitotic spindle, suggesting that α-adducin may play a role in mitotic regulation (7). Because α-adducin plays a role in regulating renal sodium reabsorption, it is not surprising that a number of studies show a relationship between ADD1 genetic polymorphisms and the development of hypertension (8-10).

  1. Matsuoka, Y. et al. (2000) Cell Mol Life Sci 57, 884-95.
  2. Joshi, R. et al. (1991) J Cell Biol 115, 665-75.
  3. Matsuoka, Y. et al. (1996) J Biol Chem 271, 25157-66.
  4. Chen, C.L. et al. (2007) J Cell Sci 120, 1157-67.
  5. Naydenov, N.G. and Ivanov, A.I. (2010) Mol Biol Cell 21, 3506-17.
  6. Fukata, Y. et al. (1999) J Cell Biol 145, 347-61.
  7. Chan, P.C. et al. (2014) J Cell Biol 204, 19-28.
  8. Kalita, J. et al. (2013) Neurol Res 35, 429-34.
  9. Kundu, A. and Anand, A. (2013) Cell Biochem Biophys 65, 13-9.
  10. Watanabe, Y. et al. (2010) Hypertens Res 33, 129-34.

Pathways & Proteins

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