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12897
ADAMTS1 (D5G4Z) Rabbit mAb
一次抗体
モノクローナル抗体

ADAMTS1 (D5G4Z) Rabbit mAb #12897

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  1. WB

Western blot analysis of extracts from various cell lines using ADAMTS1 (D5G4Z) Rabbit mAb.

To Purchase # 12897S
製品番号 サイズ 価格 在庫
12897S
100 µl

Supporting Data

REACTIVITY H
SENSITIVITY Endogenous
MW (kDa) 110
Source/Isotype Rabbit IgG

Application Key:

  • W-Western
  • IP-Immunoprecipitation
  • IHC-Immunohistochemistry
  • ChIP-Chromatin Immunoprecipitation
  • IF-Immunofluorescence
  • F-Flow Cytometry
  • E-P-ELISA-Peptide

Species Cross-Reactivity Key:

  • H-Human
  • M-Mouse
  • R-Rat
  • Hm-Hamster
  • Mk-Monkey
  • Mi-Mink
  • C-Chicken
  • Dm-D. melanogaster
  • X-Xenopus
  • Z-Zebrafish
  • B-Bovine
  • Dg-Dog
  • Pg-Pig
  • Sc-S. cerevisiae
  • Ce-C. elegans
  • Hr-Horse
  • All-All Species Expected

製品概要

アプリケーション 希釈率
ウェスタンブロッティング 1:1000

保存

Supplied in 10 mM sodium HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 100 µg/ml BSA, 50% glycerol and less than 0.02% sodium azide. Store at –20°C. Do not aliquot the antibody.

プロトコール

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ウェスタンブロッティング (WB) プロトコール

ウェスタンブロットでは、転写膜と希釈した一次抗体を静かに振盪しながら、4℃で一晩反応させてください。一次抗体の希釈液として、5% (w/v)の脱脂粉乳および0.1% Tween®20​を含む1X TBSを使用します。

注意:抗体の推奨希釈率については、各製品のデータシートまたはウェブの製品ページを参照してください。

A. 溶液および試薬

注意​:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS) (#9808):1X PBSを1 L調製する場合は、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  2. 10X Tris Buffered Saline (TBS) (#12498):1X TBSを1 L調製する場合は、10X TBS 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  3. 1X SDSサンプルバッファー (Blue Loading Pack (#7722) またはRed Loading Pack (#7723)):3X SDSローディングバッファーに、1/10量の30X DTTを加え、新しい3X 還元用ローディングバッファーを調製してください。精製水 (dH2O) で1X に希釈してください。
  4. 10X Tris-Glycine SDS Running Buffer (#4050):1X Running Bufferを1 L調製する場合、10X Running Buffer 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  5. 10X Tris-Glycine Transfer Buffer (#12539):1X Transfer Bufferを1 L調製する場合、10X Transfer Buffer 100 mLをメタノール200 mL + 精製水 (dH2O) 700 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  6. 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)​ (#9997):1X TBST を1 L調製する場合、10X TBST 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  7. Nonfat Dry Milk (脱脂粉乳) (#9999)
  8. ブロッキングバッファー:5% w/v 脱脂粉乳含有1X TBST;150 mlLを調製する場合は、脱脂粉乳7.5 gを1X TBST 150 mLに加えてよく混ぜ合わせ、完全に溶解してください。
  9. 洗浄バッファー:1X TBST;10xTBST (#9997) を精製水で10倍希釈してください (上記6をご参照ください)。
  10. 一次抗体希釈バッファー:5%脱脂粉乳含有1X TBST;20 mL調製する場合は、脱脂粉乳1.0 gを1X TBST 20 mLに加えてよく混ぜ合わせ、完全に溶解してください。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack (#7727)
  12. ​Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa) (#13953)
  13. 転写膜 (#12369):このプロトコールはニトロセルロース膜を用いて最適化されています。ポアサイズは0.2 µmをお勧めしています。
  14. HRP標識二次抗体:Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074)
  15. 検出試薬:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)

B. タンパク質のブロッティング

最も汎用的なサンプル調製プロトコール

  1. 目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 培養ディッシュから培地を吸引除去し、細胞を1X PBSで洗った後、再度吸引除去してください。
  3. 1X SDSサンプルバッファーを加え (6ウェルプレートは100 µL/ウェル、直径10 cmプレートは500 µL/プレート)、細胞を溶解してください。直ちにプレートから細胞を掻き取り、抽出物を遠心分離チューブに移してください。氷上に保持してください。
  4. 10-15秒間超音波処理してください。この処理には、細胞を完全に溶解する目的と、DNAを剪断してサンプルの粘性を下げる目的があります。
  5. サンプル20 µLを95-100℃で5分間加熱処理後、氷上で冷却してください。
  6. 5分間遠心分離してください。
  7. SDS-PAGEゲル (10 cm × 10 cm) に20 µLをアプライし、電気泳動してください。

    注意:転写確認用のPrestained Protein Marker (#13953、10 µl/lane) および分子量確認用のBiotinylated Protein Ladder (#7727、10 µL/lane) も同時に電気泳動することをお勧めしています。

  8. ニトロセルロース膜 (#12369) に転写してください。

C. 転写膜のブロッキングと抗体反応

注意:10 cm x 10 cm (100 cm2) の転写膜用の容量を記載しています。サイズの異なる転写膜をご使用の際は、適宜容量を調節してください。

I. 転写膜のブロッキング

  1. オプション:転写後、転写膜を室温で5分間、TBS 25 mLで洗ってください。
  2. 転写膜を室温で1時間、ブロッキングバッファー25 mL中でインキュベートしてください。
  3. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。

II. 一次抗体反応

  1. 一次抗体液10 mL (製品のデータシートに記載されている希釈バッファー、希釈率をもとに適切に調製してください) 中で転写膜を静かに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  3. ビオチン化プロテインマーカーを検出するため、Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074、2000倍希釈) およびAnti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075、1000–3000倍希釈) を含むブロッキングバッファー10 mL中で転写膜を静かに振盪しながら、室温で1時間インキュベートしてください。
  4. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  5. 検出操作へ進んでください (セクションD)。

D. タンパク質の検出

使用法:

  1. 転写膜に結合したHRP (抗体標識) を、TBSTで5分間、3回洗ってください。
  2. 2X Reagent Aと2X Reagent Bを等量ずつ混ぜ合わせ、1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883) を調製してください。例えば、10 mLを調製する場合は、Reagent A 5 mLをReagent B 5 mLに加えてください)。よく混ぜ合わせてください。
  3. 基質を転写膜を1分間インキュベートし、過剰な溶液を取り除き (転写膜を乾燥させないようにご注意ください) 、ラップで覆ってX線フィルムで露光してください。

* 肌に対して繰り返し露光することは避けてください。

更新:2005年6月

改訂日:2013年11月

ウェスタンブロットリプロービングプロトコール

既存の膜のリプロービングは、サンプル量が限られている場合、複数のタンパク質を独立してイムノブロットする便利な手法です。最高の結果を得るためには、リプロービングは避け、常に新しくブロッティングを行うことを推奨します。リプロービングは価値ある方法ですが、ブロットをリプロービングするごとに、バックグランドシグナルが増す可能性があります。また、リプロービング前にまず抗体複合体が除去されていることを確認し、新しい抗体の結合によるシグナルが、最初の免疫沈降実験の残りのシグナルではないことを確認してください。これは、このブロットをECL試薬で再露光し、次の一次抗体を追加する前にシグナルがないことを確かめることで、確認できます。

A. 溶液および試薬

注意:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水または同等の精製水で調製してください。

  1. ​洗浄バッファー:​Tris Buffered Saline with Tween® 20; 10X TBST (#9997) を精製水で10倍希釈してください。
  2. ストリッピングバッファー:100 mLを調製する場合は、1M Tris-HCl (pH 6.8​) 6.25 mL、20% SDS 10 mL、βメルカプトエタノール700 μLを混ぜ合わせてください。精製水 (dH20) で100 mLにしてください。使用直前に新しいバッファーを調製してください。

B. プロトコール

  1. フィルム露光後、転写膜をTBSTで各5分間、4回洗ってください。最良の結果を得るために、転写膜は乾かさないようにしてください。
  2. 転写膜をストリッピングバッファー中で緩やかに振盪しながら、50°Cで30分間インキュベートしてください。
  3. 転写膜をTBSTで各5分間、6回洗ってください。
  4. オプション:最初のシグナルを確実に除去するために、転写膜をTBST 10 mLで5分間、2回洗ってください。転写膜をLumiGLO®で穏やかに振盪しながら、室温で1分間インキュベートしてください。転写膜の過剰な液を除去してください。乾かさないでください。ラップで包んで、X線フィルムに露光してください。
  5. 再度転写膜をTBSTで各5分間、4回洗ってください。
  6. 転写膜の再利用の準備が整いました。ウェスタンブロッティングプロトコールの「I. 転写膜のブロッキング」と「II.抗体のインキュベーション」の手順に従って、検出を開始してください。

更新:2005年6月

改訂日:2016年6月

Protocol Id: 263

特異性 / 感度

ADAMTS1 (D5G4Z) Rabbit mAb recognizes endogenous levels of total ADAMTS1 protein. This antibody does not cross-react with other ADAM or ADAMTS proteins.

Species Reactivity:

ヒト

使用抗原 / 精製方法

Monoclonal antibody is produced by immunizing animals with a synthetic peptide corresponding to residues surrounding Arg187 of human ADAMTS1 protein.

バックグラウンド

A Disintegrin and Metalloprotease with Thrombospondin Motifs (ADAMTS) proteins comprise a large family of secreted zinc metalloproteases that play important roles in various processes, including organogenesis, hemostasis, and angiogenesis (1,2). ADAMTS proteases show structural similarity to ADAM proteases, but are further defined by the presence of repeated carboxy-terminal motifs homologous to the anti-angiogenic type 1 repeats of thrombospondin-1 (3). Functions ascribed to ADAMTS proteases include regulating the extracellular bioavailability of cytokines and growth factors (4, 5), regulating cell adhesion to the extracellular matrix (ECM), and remodeling of the ECM (6).

ADAMTS1 has been shown to possess potent anti-angiogenic activity in vitro (2) and is reportedly dysregulated in a number of cancer subtypes (7). Functional in vivo studies in an ADAMTS1 knockout mouse model suggested that ADAMTS1 promotes metastatic invasion of breast carcinoma cells (8). These studies showed a reduced tumor burden in ADAMTS1 knockout mice, which was linked to increased cytotoxic immune cell invasion and reduced tumor cell survival (8).

  1. Tang, B.L. and Hong, W. (1999) FEBS Lett 445, 223-5.
  2. Apte, S.S. (2009) J Biol Chem 284, 31493-7.
  3. Vázquez, F. et al. (1999) J Biol Chem 274, 23349-57.
  4. Luque, A. et al. (2003) J Biol Chem 278, 23656-65.
  5. Lu, X. et al. (2009) Genes Dev 23, 1882-94.
  6. Kuno, K. et al. (1999) J Biol Chem 274, 18821-6.
  7. Mochizuki, S. and Okada, Y. (2007) Cancer Sci 98, 621-8.
  8. Ricciardelli, C. et al. (2011) Am J Pathol 179, 3075-85.

Pathways & Proteins

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