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91131
Occludin (E6B4R) Rabbit mAb
一次抗体
モノクローナル抗体

Occludin (E6B4R) Rabbit mAb #91131

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Filter:
  1. WB
  2. IP
  3. IHC
  4. IF

Western blot analysis of extracts from DLD-1 cells, wild-type (-) or occludin knockout (+), using Occludin (E6B4R) Rabbit mAb (upper) or β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457 (lower).

Immunoprecipitation of occludin from DLD-1 cell extracts. Lane 1 is 10% input, lane 2 is Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900, and lane 3 is Occludin (E6B4R) Rabbit mAb. Western blot analysis was performed using Occludin (E6B4R) Rabbit mAb. Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (HRP Conjugate) #93702 was used as the secondary antibody.

Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded human urothelial carcinoma using Occludin (E6B4R) Rabbit mAb.

Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded human ductal breast carcinoma using Occludin (E6B4R) Rabbit mAb.

Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded human colon using Occludin (E6B4R) Rabbit mAb.

Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded human heart using Occludin (E6B4R) Rabbit mAb.

Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded human lung carcinoma using Occludin (E6B4R) Rabbit mAb (left) compared to concentration-matched Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 (right).

Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded human ovarian clear cell carcinoma using Occludin (E6B4R) Rabbit mAb.

Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded human squamous cell lung carcinoma using Occludin (E6B4R) Rabbit mAb.

Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded human T-cell lymphoma using Occludin (E6B4R) Rabbit mAb.

Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded DLD-1 cell pellets, wild-type (left, positive) or occludin knockout (right, negative), using Occludin (E6B4R) Rabbit mAb.

Confocal immunofluorescent analysis of DLD-1 cells, either wild-type (left, positive) or occludin knockout (right, negative), using Occludin (E6B4R) Rabbit mAb (green). アクチンフィラメントをDyLight™ 554 Phalloidin #13054 (赤) で染色しています。サンプルは、ProLong® Gold Antifade Reagent with DAPI #8961 (青) で封入しています。

To Purchase # 91131S
製品番号 サイズ 価格 在庫
91131S
100 µl

Supporting Data

REACTIVITY H
SENSITIVITY Endogenous
MW (kDa) 65
Source/Isotype Rabbit IgG

Application Key:

  • W-Western
  • IP-Immunoprecipitation
  • IHC-Immunohistochemistry
  • ChIP-Chromatin Immunoprecipitation
  • IF-Immunofluorescence
  • F-Flow Cytometry
  • E-P-ELISA-Peptide

Species Cross-Reactivity Key:

  • H-Human
  • M-Mouse
  • R-Rat
  • Hm-Hamster
  • Mk-Monkey
  • Mi-Mink
  • C-Chicken
  • Dm-D. melanogaster
  • X-Xenopus
  • Z-Zebrafish
  • B-Bovine
  • Dg-Dog
  • Pg-Pig
  • Sc-S. cerevisiae
  • Ce-C. elegans
  • Hr-Horse
  • All-All Species Expected

製品概要

アプリケーション 希釈率
ウェスタンブロッティング 1:1000
免疫沈降 1:50
免疫組織化学染色プロトコール (パラフィン切片) 1:100 - 1:400
免疫蛍光染色 (免疫細胞染色) 1:100 - 1:400

保存

Supplied in 10 mM sodium HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 100 µg/ml BSA, 50% glycerol and less than 0.02% sodium azide. Store at –20°C. Do not aliquot the antibody.

プロトコール

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ウェスタンブロッティング (WB) プロトコール

ウェスタンブロットでは、転写膜と希釈した一次抗体を静かに振盪しながら、4℃で一晩反応させてください。一次抗体の希釈液として、5% (w/v) BSAおよび0.1% Tween®20​を含む1X TBSを使用してください。

注意:抗体の推奨希釈率については、各製品のデータシートまたはウェブの製品ページを参照してください。

A. 溶液および試薬

サンプル調製から検出まで、ウェスタンブロットに必要な全ての試薬が一つの便利なキット、Western Blotting Application Solutions Kit #12957になりました。

注意​:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS) (#9808):1X PBSを1 L調製する場合は、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  2. 10X Tris Buffered Saline (TBS) (#12498):1X TBSを1 L調製する場合は、10X TBS 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  3. 1X SDSサンプルバッファー (Blue Loading Pack (#7722) またはRed Loading Pack (#7723)):3X SDSローディングバッファーに、1/10量の30X DTTを加え、新しい3X 還元用ローディングバッファーを調製してください。精製水 (dH2O) で1X に希釈してください。
  4. 10X Tris-Glycine SDS Running Buffer (#4050):1X Running Bufferを1 L調製する場合、10X Running Buffer 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  5. 10X Tris-Glycine Transfer Buffer (#12539):1X Transfer Bufferを1 L調製する場合、10X Transfer Buffer 100 mLをメタノール200 mL + 精製水 (dH2O) 700 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  6. 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)​ (#9997):1X TBST を1 L調製する場合、10X TBST 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  7. Nonfat Dry Milk (脱脂粉乳) (#9999)
  8. ブロッキングバッファー:5% w/v 脱脂粉乳含有1X TBST;150 mlLを調製する場合は、脱脂粉乳7.5 gを1X TBST 150 mLに加えてよく混ぜ合わせ、完全に溶解してください。
  9. 洗浄バッファー:1X TBST;10xTBST (#9997) を精製水で10倍希釈してください (上記6をご参照ください)。
  10. ウシ血清アルブミン (BSA) (#9998)
  11. 一次抗体希釈バッファー:5% BSA含有1X TBST;20 mLを調製する場合は、BSA 1.0 gを1X TBST 20 mLに加えてよく混ぜ合わせ、完全に溶解してください。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack (#7727)
  13. ​Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa) (#13953)
  14. 転写膜 (#12369):このプロトコールはニトロセルロース膜を用いて最適化されています。ポアサイズは0.2 µmをお勧めしています。
  15. HRP標識二次抗体:Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074)
  16. 検出試薬:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)

B. タンパク質のブロッティング

最も汎用的なサンプル調製プロトコール

  1. 目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 培養ディッシュから培地を吸引除去し、細胞を1X PBSで洗った後、再度吸引除去してください。
  3. 1X SDSサンプルバッファーを加え (6ウェルプレートは100 µL/ウェル、直径10 cmプレートは500 µL/プレート)、細胞を溶解してください。直ちにプレートから細胞を掻き取り、抽出物を遠心分離チューブに移してください。氷上に保持してください。
  4. 10-15秒間超音波処理してください。この処理には、細胞を完全に溶解する目的と、DNAを剪断してサンプルの粘性を下げる目的があります。
  5. サンプル20 µLを95-100℃で5分間加熱処理後、氷上で冷却してください。
  6. 5分間遠心分離してください。
  7. SDS-PAGEゲル (10 cm × 10 cm) に20 µLをアプライし、電気泳動してください。

    注意:転写確認用のPrestained Protein Marker (#13953、5 µl/lane) および分子量確認用のBiotinylated Protein Ladder (#7727、10 µL/lane) も同時に電気泳動することをお勧めしています。

  8. ニトロセルロース膜 (#12369) に転写してください。

C. 転写膜のブロッキングと抗体反応

注意:10 cm x 10 cm (100 cm2) の転写膜用の容量を記載しています。サイズの異なる転写膜をご使用の際は、適宜容量を調節してください。

I. 転写膜のブロッキング

  1. オプション:転写後、転写膜を室温で5分間、TBS 25 mLで洗ってください。
  2. 転写膜を室温で1時間、ブロッキングバッファー25 mL中でインキュベートしてください。
  3. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。

II. 一次抗体反応

  1. 一次抗体液10 mL (製品のデータシートに記載されている希釈バッファー、希釈率をもとに適切に調製してください) 中で転写膜を静かに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  3. ビオチン化プロテインマーカーを検出するため、Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074、1:2000希釈) およびAnti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075、1:1000–1:3000希釈) を含むブロッキングバッファー10 mL中で転写膜を静かに振盪しながら、室温で1時間インキュベートしてください。
  4. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  5. 検出操作へ進んでください (セクションD)。

D. タンパク質の検出

使用法:

  1. 転写膜に結合したHRP (抗体標識) を、TBSTで5分間、3回洗ってください。
  2. 2X Reagent Aと2X Reagent Bを等量ずつ混ぜ合わせ、1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883) を調製してください。例えば、10 mLを調製する場合は、Reagent A 5 mLをReagent B 5 mLに加えてください。よく混ぜ合わせてください。
  3. 基質を転写膜を1分間インキュベートし、過剰な溶液を取り除き (転写膜を乾燥させないようにご注意ください) 、ラップで覆ってX線フィルムで露光してください。

* 肌に対して繰り返し露光することは避けてください。

更新:2005年6月

改訂日:2013年11月

ウェスタンブロットリプロービングプロトコール

既存の膜のリプロービングは、サンプル量が限られている場合、複数のタンパク質を独立してイムノブロットする便利な手法です。最高の結果を得るためには、リプロービングは避け、常に新しくブロッティングを行うことを推奨します。リプロービングは価値ある方法ですが、ブロットをリプロービングするごとに、バックグランドシグナルが増す可能性があります。また、リプロービング前にまず抗体複合体が除去されていることを確認し、新しい抗体の結合によるシグナルが、最初の免疫沈降実験の残りのシグナルではないことを確認してください。これは、このブロットをECL試薬で再露光し、次の一次抗体を追加する前にシグナルがないことを確かめることで、確認できます。

A. 溶液および試薬

注意:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水または同等の精製水で調製してください。

  1. ​洗浄バッファー:​Tris Buffered Saline with Tween® 20; 10X TBST (#9997) を精製水で10倍希釈してください。
  2. ストリッピングバッファー:100 mLを調製する場合は、1M Tris-HCl (pH 6.8​) 6.25 mL、20% SDS 10 mL、βメルカプトエタノール700 μLを混ぜ合わせてください。精製水 (dH20) で100 mLにしてください。使用直前に新しいバッファーを調製してください。

B. プロトコール

  1. フィルム露光後、転写膜をTBSTで各5分間、4回洗ってください。最良の結果を得るために、転写膜は乾かさないようにしてください。
  2. 転写膜をストリッピングバッファー中で緩やかに振盪しながら、50°Cで30分間インキュベートしてください。
  3. 転写膜をTBSTで各5分間、6回洗ってください。
  4. オプション:最初のシグナルを確実に除去するために、転写膜をTBST 10 mLで5分間、2回洗ってください。転写膜をLumiGLO®で穏やかに振盪しながら、室温で1分間インキュベートしてください。転写膜の過剰な液を除去してください。乾かさないでください。ラップで包んで、X線フィルムに露光してください。
  5. 再度転写膜をTBSTで各5分間、4回洗ってください。
  6. 転写膜の再利用の準備が整いました。ウェスタンブロッティングプロトコールの「I. 転写膜のブロッキング」と「II.抗体のインキュベーション」の手順に従って、検出を開始してください。

更新:2005年6月

改訂日:2016年10月

Protocol Id: 10

未変性タンパク質の免疫沈降

このプロトコールは、Protein A Agarose Beadsで未変性タンパク質を免疫沈降し、ウェスタンブロッティングまたはキナーゼ活性による解析を行う場合にご使用いただけます。

A. 溶液および試薬

注意​:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS) ​(#9808):1X PBSを1 Lを調製する場合は、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  2. 10X Cell Lysis Buffer (#9803):1X Cell Lysis Bufferを10 mL調製する場合は、10X Cell Lysis Buffer 1 mLを精製水 (dH2O) 9 mlに加え、混ぜ合わせてください。

    注意:使用直前に1 mM PMSF (#8553) を加えてください

  3. 3X SDS Sample Buffer (Blue Loading Pack (#7722) またはRed Loading Pack (#7723)):3X SDSローディングバッファーに1/10​量の30X DTTを加え、新しい3X 還元用ローディングバッファーを調製してください。
  4. Protein A Agarose Beads (#9863)
  5. 10X Kinase Buffer (キナーゼアッセイ用) (#9802):1X Kinase Bufferを1 mL調製する場合は、10X Kinase Buffer 100 µLを精製水 (dH2O) 900 µLに加えて、混ぜ合わせてください。
  6. ATP (10 mM) (キナーゼアッセイ用) (#9804):ATP (200 µM) を0.5 mL調製する場合は、ATP (10 mM) 10 µLを1X Kinase Buffer 490µLに加えてください。

B. 細胞ライセートの調製

  1. 培地を吸引してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 未変性状態で細胞を採取するために、培地を除去し、氷冷した1X PBSで細胞を1回洗ってください。
  3. PBSを除去し、各プレート (10 cm) に氷冷した1X Cell Lysis Buffer 0.5 mLを加え、氷上で5分間インキュベートしてください。
  4. プレートから細胞を掻き取り、遠心分離用チューブに移してください。氷上に保持してください。
  5. 氷上で超音波処理を3回 (各5秒間) 行なってください。
  6. 4°C、14,000​ x gで10分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。必要に応じて、ライセートは-80°Cで保存することができます。

C. 免疫沈降

細胞ライセートのプレクリア (オプション)

  1. ビーズのストックをボルテックスして混ぜ合わせてください。
  2. 50%のProtein A Agarose Beadsスラリー 10–30 µLを、1 mg/mLの細胞ライセート200 µLに加えてください。
  3. ローテーターを用いて、4°Cで30-60分間インキュベートしてください。
  4. 4°Cで10分間遠心分離してください。上清を新しいチューブに移してください。
  5. 次の免疫沈降へと進んでください。

免疫沈降

  1. 製品データシートに記載されている推奨希釈率に従い、一次抗体を、1 mg/mLの細胞ライセート 200 µLに加えてください。ローテーターを用いて、4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. Protein A Agarose Beads (50% ビーズスラリー) を10–30 µL加えてください。ローテーターを用いて、4°Cで1–3時間インキュベートしてください。
  3. 4°Cで30秒間遠心分離してください。ペレットを1X Cell Lysis Buffer 500 µLで5回洗ってください。洗いの操作は氷上で行ってください。
  4. ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼ活性分析 (セクション D) で解析してください。

D. サンプルの解析

以下のステップから適切な操作に進んでください。

ウェスタンブロッティングで解析する場合

  1. 3X SDS Sample Buffer 20 µLにペレットを再懸濁してください。ボルテックスした後、14,000 x gで30秒間、遠心分離してください。
  2. サンプルを95-100°Cで2-5分間加熱し、14,000 x gで1分間遠心分離してください。
  3. サンプル (15-30 µL) をSDS-PAGEゲル (4–20%) にロードしてください。
  4. サンプルをウェスタンブロット解析してください (ウェスタンブロッティングプロトコールをご覧ください)。

注意:免疫沈降に用いた一次抗体がウェスタンブロットで検出されることがあります。変性IgG重鎖 (およそ50 kDa) によって起こる、目的タンパク質のマスキングを最小化する場合は、Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb (#3677) またはMouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (またはHRP conjugate #5127) の使用を推奨します。変性IgG軽鎖 (およそ25 kDa) によって起こるマスキングを最小化する場合は、Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (またはHRP conjugate #5127) の使用を推奨します。

キナーゼアッセイで解析する場合

  1. ペレットを1X Kinase Buffer 500 µLで2回洗ってください。氷上に保持してください。
  2. 200 µM ATPと適切な基質を添加した1X Kinase Buffer 40 µLでペレットを懸濁してください。
  3. 30°Cで30分間インキュベートしてください。
  4. 3X SDSサンプルバッファー20 µLで反応を停止させます。ボルテックスした後、30秒間遠心分離してください。
  5. リン酸化基質を含む上清を、新しいチューブに移して下さい。
  6. サンプルを95-100°Cで2-5分間加熱し、14,000 x gで1分間遠心分離してください。
  7. サンプル (15-30 µL) をSDS-PAGEゲル (4–20%) にロードしてください。

更新:2008年12月

改訂日:2018年4月

Protocol Id: 409

免疫組織化学染色プロトコール (パラフィン切片)

A. 溶液および試薬

注意​:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. キシレン
  2. エタノール、無水変性、病理学グレード (100%および95%)
  3. 脱イオン水 (dH2O)
  4. ヘマトキシリン (オプション)
  5. 洗浄バッファー
    1. 1X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)​:1X TBST 1 Lを調製する場合は、10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (#9997) 100 mLを精製水 (dH20)​ 900 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  6. SignalStain® Antibody Diluent (#8112)
  7. 1X クエン酸賦活化液:250 mLを調製する場合は、SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 25 mLを精製水 (dH2O) 225 mLで希釈してください。
  8. 3%過酸化水素水​:100 mLを調製する場合は、30%過酸化水素水 (H2O2) 10 mLを精製水 (dH2O) 90 mLに加えてください。
  9. ブロッキング液​:5%正常ヤギ血清/TBSTまたは1X Animal-Free Blocking Solution
    1. TBST/5%正常ヤギ血清:Normal Goat Serum (#5425) 250 µLを1X TBST 5 mLに加えてください。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution:Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019) 1 mLを精製水 (dH2O) 4 mLに加えてください。
  10. 検出システム​:SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Rabbit #8114)
  11. ​発色基質​:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)
  12. ヘマトキシリン:Hematoxylin (#14166)
  13. ​封入剤:SignalStain® Mounting Medium (#14177)

B. 脱パラフィン/再水和

注意:操作の間は、常にスライドを乾かさないようにしてください。

  1. 切片の脱パラフィン/水和:
    1. キシレンで切片を各5分間、3回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
    3. 95%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
  2. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、2回洗ってください。

C. 抗原賦活化

クエン酸バッファーの場合:切片を1X クエン酸賦活化液に浸漬した状態で、沸騰し始めるまで電子レンジで加熱し、沸騰直前の温度 (95°-98°C) を10分間維持してください。スライドを実験台で30分間冷却してください。

D. 染色

  1. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、3回洗ってください。
  2. 3%過酸化水素で切片を10分間インキュベートしてください。
  3. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、2回洗ってください。
  4. 洗浄バッファーで切片を5分間洗ってください。
  5. ブロッキング液100​-400 μLで各切片を室温で1時間ブロッキングしてください。
  6. ブロッキング液を除去し、SignalStain®​ Antibody Diluent (#8112) で希釈した一次抗体100-400 μLを各切片に加えてください。4℃で一晩インキュベートしてください。
  7. SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114​) を室温に戻してください。
  8. 抗体液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください。
  9. 1-3滴のSignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) で切片を覆ってください。加湿チャンバー内 (室温) で30分間インキュベートしてください。
  10. 洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください。
  11. 使用前にSignalStain® DAB Chromogen Concentrate 1滴 (30 µL) をSignalStain® DAB Diluent 1 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  12. 調製したSignalStain® DAB溶液 100-400 µLを各切片に加え、注意深く観察してください。通常は1-10分で十分な染色強度が得られます。
  13. スライドを精製水 (dH2O) に浸してください。
  14. 必要に応じて、Hematoxylin (#14166) で切片を対比染色してください。
  15. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、2回洗ってください。
  16. 切片を脱水してください:
    1. 95%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    3. キシレンで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
  17. カバーガラスとMounting Medium (#14177) で切片を封入してください。

検出試薬と基質の互換性
RECOMMENDED
DETECTION REAGENTS
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653
COMPATIBLE
CHROMOGEN
SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632  

注意:このプロトコールで指定されているもの以外の検出試薬を使用する場合は、その検出試薬の感度が異なることを考慮して、一次抗体をさらに最適化する必要があります。


更新:2010年2月

改訂日:2020年4月

Protocol Id: 283

免疫蛍光染色 (免疫細胞染色)

A. 溶液および試薬

効率的でお得な調製済み試薬が入った#12727 Immunofluorescence Application Solutions Kitを使用して、質の高い免疫蛍光染色画像データを取得しましょう。

注意​:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS):(#9808) 1X PBS 1 Lを用意する場合は、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。pHを8.0に調整してください。
  2. ホルムアルデヒド:16%、メタノール不含、Polysciences, Inc. (cat# 18814)、新しいものを使用し、開封した瓶は暗所で4℃で保存してください。使用する際は1X PBSで希釈してください。
  3. ブロッキングバッファー​ (1X PBS/5%正常血清/0.3% Triton™ X-100):10 mLを用意する場合は、二次抗体の免疫動物と同じ動物種の正常血清0.5 mL (例:Normal Goat Serum (#5425)) と20X PBS 0.5 mLを精製水 (dH2O) 9.0 mLに加えてよく混ぜ合わせてください。スターラーで撹拌しながら、Triton™ X-100 30 µLを加えてください。
  4. 抗体希釈バッファー ​(1X PBS/1% BSA/0.3% Triton™ X-100):10 mLを用意する場合は、Triton™ X-100 30 μLを1X PBS 10 mLに加えてください。混ぜ合わせた後、BSA (9998​) 0.1 gを加えてよく混ぜ合わせてください。
  5. 推奨される蛍光標識抗ウサギ二次抗体:

  6. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)、Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)

B. 試料作製 - 培養細胞株 (IF-IC)

注意:マルチウェルプレート、チャンバースライドあるいはカバーガラス上で直接細胞を培養、薬剤処理、固定および染色してください。

  1. 溶液を吸引除去し、細胞が2 - 3 mm浸る程の4%ホルムアルデヒド (1X PBSで希釈) を加えてください。

    注意:ホルムアルデヒドは毒性があるので、ドラフトチャンバー内でのみ使用してください。

  2. 細胞を室温で15分間固定してください。
  3. 固定液を吸引除去し、1X PBSで各5分間、3回すすいでください。
  4. 免疫染色操作に進んでください (セクションC)。

C. 免疫染色

注意:特に指定がなければこれ以降のインキュベーションは室温で行い、乾燥と蛍光色素の退色防止のため、遮光湿潤箱や蓋付きのディッシュ/プレートを使用してください。

  1. ブロッキングバッファーでサンプルを60分間ブロッキングしてください。
  2. ブロッキングしている間に、データシートの記載に従って一次抗体を抗体希釈バッファーで希釈してください。
  3. ブロッキング液を吸引除去し、希釈した一次抗体を加えてください。
  4. 4℃で一晩インキュベートしてください。
  5. 1X PBSで各5分間、3回すすいでください。
  6. 抗体希釈バッファーで希釈した蛍光標識二次抗体を加え、サンプルを暗所、室温で1 - 2時間インキュベートしてください。
  7. 1X PBSで各5分間、3回すすいでください。
  8. 切片をProlong® Gold Antifade Reagent (#9071)、あるいはProlong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) とカバーガラスで覆ってください。
  9. 最良の結果を得るために、封入剤を室温で一晩硬化させてください。スライドを長期保存する際は、4°C、暗所で、水平にして保存してください。

更新:2006年11月

改訂日:2013年11月

Protocol Id: 24

特異性 / 感度

Occludin (E6B4R) Rabbit mAb recognizes endogenous levels of total occludin protein.

Species Reactivity:

ヒト

使用抗原 / 精製方法

Monoclonal antibody is produced by immunizing animals with a synthetic peptide corresponding to residues surrounding Val294 of human occludin protein.

バックグラウンド

Tight junctions, or zona occludens, form a continuous barrier to fluids across the epithelium and endothelium. They function in regulation of paracellular permeability and in the maintenance of cell polarity, blocking the movement of transmembrane proteins between the apical and the basolateral cell surfaces (reviewed in 1). Tight junctions are composed of claudin and occludin transmembrane proteins, which join the junctions to the cytoskeleton (1,2). Occludinは、密着結合の組み立てと維持において重要であると考えられています。Differential phosphorylation of occludin at various residues may regulate its interaction with other tight junction proteins such as ZO-1 (3). VEGF-induced phosphorylation of occludin regulates tight junction stability and vascular permeability (4). Expression of occludin as well as claudin1 is required for infection of liver cells by hepatitis C virus (HCV) (5).

  1. Shin, K. et al. (2006) Annu Rev Cell Dev Biol 22, 207-35.
  2. Oliveira, S.S. and Morgado-Díaz, J.A. (2007) Cell Mol Life Sci 64, 17-28.
  3. Rao, R. (2009) Ann N Y Acad Sci 1165, 62-8.
  4. Murakami, T. et al. (2009) J Biol Chem 284, 21036-46.
  5. Ploss, A. et al. (2009) Nature 457, 882-6.

Pathways & Proteins

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