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83732
Poly/Mono-ADP Ribose (E6F6A) Rabbit mAb
一次抗体
モノクローナル抗体

Poly/Mono-ADP Ribose (E6F6A) Rabbit mAb #83732

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  1. WB

Western blot analysis of Colo 205 cells treated (+) with combinations of the following treatments as indicated: hydrogen peroxide (500 μM, 5 min), hydrogen peroxide-treated lysates treated with phosphodiesterase 1 (0.5 μg/mL, 4 hr at 37ºC), or with tcPARG (5 μM, 4 hr at 37ºC ) using Poly/Mono-ADP Ribose (E6F6A) Rabbit mAb (upper), or GAPDH (D16H11) XP® Rabbit mAb #5174 (lower).

Western blot analysis of Colo 205 cells untreated (-), or treated with hydrogen peroxide (500 μM, 5 min; +), using Poly/Mono-ADP Ribose (E6F6A) Rabbit mAb (upper), or β-Tubulin (9F3) Rabbit mAb #2128 (lower).

To Purchase # 83732S
製品番号 サイズ 価格 在庫
83732S
100 µl

Supporting Data

REACTIVITY All
SENSITIVITY Endogenous
MW (kDa)
Source/Isotype Rabbit IgG

Application Key:

  • W-Western
  • IP-Immunoprecipitation
  • IHC-Immunohistochemistry
  • ChIP-Chromatin Immunoprecipitation
  • IF-Immunofluorescence
  • F-Flow Cytometry
  • E-P-ELISA-Peptide

Species Cross-Reactivity Key:

  • H-Human
  • M-Mouse
  • R-Rat
  • Hm-Hamster
  • Mk-Monkey
  • Mi-Mink
  • C-Chicken
  • Dm-D. melanogaster
  • X-Xenopus
  • Z-Zebrafish
  • B-Bovine
  • Dg-Dog
  • Pg-Pig
  • Sc-S. cerevisiae
  • Ce-C. elegans
  • Hr-Horse
  • All-All Species Expected

製品概要

アプリケーション 希釈率
ウェスタンブロッティング 1:1000

保存

Supplied in 10 mM sodium HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 100 µg/ml BSA, 50% glycerol and less than 0.02% sodium azide. Store at –20°C. Do not aliquot the antibody.

プロトコール

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ウェスタンブロッティング (WB) プロトコール

ウェスタンブロットでは、転写膜と希釈した一次抗体を静かに振盪しながら、4℃で一晩反応させてください。一次抗体の希釈液として、5% (w/v) BSAおよび0.1% Tween®20​を含む1X TBSを使用してください。

注意:抗体の推奨希釈率については、各製品のデータシートまたはウェブの製品ページを参照してください。

A. 溶液および試薬

サンプル調製から検出まで、ウェスタンブロットに必要な全ての試薬が一つの便利なキット、Western Blotting Application Solutions Kit #12957になりました。

注意​:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS) (#9808):1X PBSを1 L調製する場合は、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  2. 10X Tris Buffered Saline (TBS) (#12498):1X TBSを1 L調製する場合は、10X TBS 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  3. 1X SDSサンプルバッファー (Blue Loading Pack (#7722) またはRed Loading Pack (#7723)):3X SDSローディングバッファーに、1/10量の30X DTTを加え、新しい3X 還元用ローディングバッファーを調製してください。精製水 (dH2O) で1X に希釈してください。
  4. 10X Tris-Glycine SDS Running Buffer (#4050):1X Running Bufferを1 L調製する場合、10X Running Buffer 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  5. 10X Tris-Glycine Transfer Buffer (#12539):1X Transfer Bufferを1 L調製する場合、10X Transfer Buffer 100 mLをメタノール200 mL + 精製水 (dH2O) 700 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  6. 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)​ (#9997):1X TBST を1 L調製する場合、10X TBST 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  7. Nonfat Dry Milk (脱脂粉乳) (#9999)
  8. ブロッキングバッファー:5% w/v 脱脂粉乳含有1X TBST;150 mlLを調製する場合は、脱脂粉乳7.5 gを1X TBST 150 mLに加えてよく混ぜ合わせ、完全に溶解してください。
  9. 洗浄バッファー:1X TBST;10xTBST (#9997) を精製水で10倍希釈してください (上記6をご参照ください)。
  10. ウシ血清アルブミン (BSA) (#9998)
  11. 一次抗体希釈バッファー:5% BSA含有1X TBST;20 mLを調製する場合は、BSA 1.0 gを1X TBST 20 mLに加えてよく混ぜ合わせ、完全に溶解してください。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack (#7727)
  13. ​Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa) (#13953)
  14. 転写膜 (#12369):このプロトコールはニトロセルロース膜を用いて最適化されています。ポアサイズは0.2 µmをお勧めしています。
  15. HRP標識二次抗体:Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074)
  16. 検出試薬:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)

B. タンパク質のブロッティング

最も汎用的なサンプル調製プロトコール

  1. 目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 培養ディッシュから培地を吸引除去し、細胞を1X PBSで洗った後、再度吸引除去してください。
  3. 1X SDSサンプルバッファーを加え (6ウェルプレートは100 µL/ウェル、直径10 cmプレートは500 µL/プレート)、細胞を溶解してください。直ちにプレートから細胞を掻き取り、抽出物を遠心分離チューブに移してください。氷上に保持してください。
  4. 10-15秒間超音波処理してください。この処理には、細胞を完全に溶解する目的と、DNAを剪断してサンプルの粘性を下げる目的があります。
  5. サンプル20 µLを95-100℃で5分間加熱処理後、氷上で冷却してください。
  6. 5分間遠心分離してください。
  7. SDS-PAGEゲル (10 cm × 10 cm) に20 µLをアプライし、電気泳動してください。

    注意:転写確認用のPrestained Protein Marker (#13953、5 µl/lane) および分子量確認用のBiotinylated Protein Ladder (#7727、10 µL/lane) も同時に電気泳動することをお勧めしています。

  8. ニトロセルロース膜 (#12369) に転写してください。

C. 転写膜のブロッキングと抗体反応

注意:10 cm x 10 cm (100 cm2) の転写膜用の容量を記載しています。サイズの異なる転写膜をご使用の際は、適宜容量を調節してください。

I. 転写膜のブロッキング

  1. オプション:転写後、転写膜を室温で5分間、TBS 25 mLで洗ってください。
  2. 転写膜を室温で1時間、ブロッキングバッファー25 mL中でインキュベートしてください。
  3. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。

II. 一次抗体反応

  1. 一次抗体液10 mL (製品のデータシートに記載されている希釈バッファー、希釈率をもとに適切に調製してください) 中で転写膜を静かに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  3. ビオチン化プロテインマーカーを検出するため、Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074、1:2000希釈) およびAnti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075、1:1000–1:3000希釈) を含むブロッキングバッファー10 mL中で転写膜を静かに振盪しながら、室温で1時間インキュベートしてください。
  4. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  5. 検出操作へ進んでください (セクションD)。

D. タンパク質の検出

使用法:

  1. 転写膜に結合したHRP (抗体標識) を、TBSTで5分間、3回洗ってください。
  2. 2X Reagent Aと2X Reagent Bを等量ずつ混ぜ合わせ、1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883) を調製してください。例えば、10 mLを調製する場合は、Reagent A 5 mLをReagent B 5 mLに加えてください。よく混ぜ合わせてください。
  3. 基質を転写膜を1分間インキュベートし、過剰な溶液を取り除き (転写膜を乾燥させないようにご注意ください) 、ラップで覆ってX線フィルムで露光してください。

* 肌に対して繰り返し露光することは避けてください。

更新:2005年6月

改訂日:2013年11月

ウェスタンブロットリプロービングプロトコール

既存の膜のリプロービングは、サンプル量が限られている場合、複数のタンパク質を独立してイムノブロットする便利な手法です。最高の結果を得るためには、リプロービングは避け、常に新しくブロッティングを行うことを推奨します。リプロービングは価値ある方法ですが、ブロットをリプロービングするごとに、バックグランドシグナルが増す可能性があります。また、リプロービング前にまず抗体複合体が除去されていることを確認し、新しい抗体の結合によるシグナルが、最初の免疫沈降実験の残りのシグナルではないことを確認してください。これは、このブロットをECL試薬で再露光し、次の一次抗体を追加する前にシグナルがないことを確かめることで、確認できます。

A. 溶液および試薬

注意:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水または同等の精製水で調製してください。

  1. ​洗浄バッファー:​Tris Buffered Saline with Tween® 20; 10X TBST (#9997) を精製水で10倍希釈してください。
  2. ストリッピングバッファー:100 mLを調製する場合は、1M Tris-HCl (pH 6.8​) 6.25 mL、20% SDS 10 mL、βメルカプトエタノール700 μLを混ぜ合わせてください。精製水 (dH20) で100 mLにしてください。使用直前に新しいバッファーを調製してください。

B. プロトコール

  1. フィルム露光後、転写膜をTBSTで各5分間、4回洗ってください。最良の結果を得るために、転写膜は乾かさないようにしてください。
  2. 転写膜をストリッピングバッファー中で緩やかに振盪しながら、50°Cで30分間インキュベートしてください。
  3. 転写膜をTBSTで各5分間、6回洗ってください。
  4. オプション:最初のシグナルを確実に除去するために、転写膜をTBST 10 mLで5分間、2回洗ってください。転写膜をLumiGLO®で穏やかに振盪しながら、室温で1分間インキュベートしてください。転写膜の過剰な液を除去してください。乾かさないでください。ラップで包んで、X線フィルムに露光してください。
  5. 再度転写膜をTBSTで各5分間、4回洗ってください。
  6. 転写膜の再利用の準備が整いました。ウェスタンブロッティングプロトコールの「I. 転写膜のブロッキング」と「II.抗体のインキュベーション」の手順に従って、検出を開始してください。

更新:2005年6月

改訂日:2016年10月

Protocol Id: 10

特異性 / 感度

Poly/Mono-ADP Ribose (E6F6A) RmAb recognizes endogenous levels of ADP ribosylated proteins and does not cross-react with other post translational modifications.

Species Reactivity:

All Species Expected

使用抗原 / 精製方法

Monoclonal antibody is produced by immunizing animals with KLH modified on lysines with ADP ribose.

バックグラウンド

ADP-ribosylation is a post-translational modification that has been described to occur on the side chain of several acceptor residues (lysine, arginine, glutamate, aspartate, cysteine, serine) and protein amino termini as well as on DNA and tRNA (1). ADP-ribosyl transferases (ADPRTs) catalyze the transfer of ADP-ribose from β-NAD+ and release nicotinamide in the process. Mono-ADP-ribosyl transferases (MARTs, or monoPARPs) comprise the vast majority of the ADPRTs. These monoenzymes, which include the sirtuins and many of the PARP (ARTD) and ART proteins, transfer a single ADP-ribose unit to the target residue (MARylation). The poly-ADP-ribose polymerases (polyPARPs) or polyenzymes, which include human PARP1, 2, 5a and 5b, are the most widely studied and can polymerize linear or branched chains of up to ~200 ADPR units (2). Specificity is determined primarily, but not exclusively, by a nonconsecutive catalytic triad motif, with some exceptions. Those containing the R-S-E motif like Cholera toxin are arginine-directed transferases, while those containing the H-Y-E triad tend to exhibit polymerase activity (3,4). ADP-ribosylation is reversible and can be degraded down to a single ADP-ribose unit by poly-ADP-ribose glycohydrolase (PARG) or ADP-ribosylhydrolase 3 (ARH3) or completely removed from the target residue by ARH1, TARG1, MacroD1 or MacroD2 (5).

ADP-ribosylation is involved in a variety of cellular processes, including mitotic spindle formation, chromatin decondensation, cell stress response, retroviral silencing, RNA biology, and transcription, but the most well-known function of ADP-ribose chains is to serve as a scaffold for recruiting DNA repair proteins that contain PAR-binding modules to sites of DNA damage (6). X-ray repair cross-complementing protein 1 (XRCC1), histone macroH2A1, RNF146 (Iduna) an E3 ubiquitin ligase, and many of the PARPs themselves, among others, contain PAR-binding motifs (PBMs) or domains: WWE, PAR-binding zinc-finger (PBZ), or macrodomains (7). PARylation has a central role in cell survival, and is tightly regulated. PARP deficiency can leave a cell vulnerable to DNA damage-induced apoptosis, while hyper PARylation can lead to parthanatos, a unique form of cell death (8). The role of PARylation in DNA repair has inspired great interest in developing candidate drug inhibitors for PARP, in particular to treat breast, prostate and small cell lung cancers with mutations in DNA repair genes like BRCA1/2, CHK2 or ATM. Stat1, PERK, p53, G-actin and Ras are just a few examples of proteins that are functionally modulated by ADP-ribosylation (6,7). Modification by ADP-ribose can block protein interactions or, in the case of P2X7, cause a conformational change that in the presence of ART2 expression sensitizes naive murine T-cells to extracellular NAD+ leading to apoptosis (9).

  1. Koch-Nolte, F. et al. (2008) Front Biosci 13, 6716-29.
  2. Leung, A.K. (2014) J Cell Biol 205, 613-9.
  3. Laing, S. et al. (2011) Amino Acids 41, 257-69.
  4. Vyas, S. et al. (2014) Nat Commun 5, 4426.
  5. Vivelo, C.A. and Leung, A.K. (2015) Proteomics 15, 203-17.
  6. Gupte, R. et al. (2017) Genes Dev 31, 101-126.
  7. Wei, H. and Yu, X. (2016) Genomics Proteomics Bioinformatics 14, 131-139.
  8. David, K.K. et al. (2009) Front Biosci (Landmark Ed) 14, 1116-28.
  9. Seman, M. et al. (2003) Immunity 19, 571-82.
研究用のみ。診断手順では使用しません。

Cell Signaling Technology is a trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
XPはCell Signaling Technology, Inc.の商標です。
TweenはICI Americas, Inc.の登録商標です。

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