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フローサイトメトリー

フローサイトメトリーは伝統的に、細胞外または表面マーカーの発現に基づいて、不均一な細胞プール内で特定の細胞腫を特定するために使用されており、一般的に免疫表現型検査として知られるアプリケーションです。しかし、この手法は細胞内標的の検出にも適用しやすく、複雑なシグナル伝達経路の研究にうまく活用できる可能性があります。

細胞表面マーカーの検出と組み合わせることで、細胞内フローサイトメトリーは強力なプラットフォームへと進化し、表現型の異なる細胞集団内の単一細胞レベルでのシグナル伝達ネットワークの特性解析が可能になります。

細胞内フローサイトメトリーの利点:

  1. 細胞表面、細胞質、核区画に局在するタンパク質の同時検出が可能
  2. 細胞の表現系との直接相関
    • 細胞内タンパク質発現の相関性を直接的に解析することが可能
    • サイトカイン放出、転写因子の産生などの機能的な結果の相関性を直接的に解析することが可能
  3. 単一細胞ベースでのシグナル伝達の研究が可能
  4. 細胞懸濁液を使用したパスウェイの活性化/抑制の研究が可能
  5. 細胞内タンパク質発現の定量的評価が可能

細胞内フローサイトメトリーは、ウェスタンブロット解析と比較して、シグナル伝達研究でのユニークな利点があります。ウェスタンブロットはプールされた細胞集団からタンパク質レベルを検出します。従って、低い割合の細胞で起こる、稀なシグナル伝達イベントを検出するには、十分な感度が得られないこともあります。これは、陰性の結果として間違った解釈をされる可能性があります。フローサイトメトリーは、単一細胞レベルのイベントを測定できることから、稀に起こるシグナル伝達イベント (下記の例を参照) の同定をすることができます。

ウェスタンブロット

ウェスタンブロット

細胞内フローサイトメトリー

細胞内フローサイトメトリー

非受容体型細胞質チロシンキナーゼであるSykは、B細胞受容体 (BCR) が活性化されることでリン酸化され、BCRからのシグナルを細胞内に伝えます。
IgM (10 μg/mL) で10分間処理したPBMC集団と、未処理コントロールの細胞集団のSykの活性化をウェスタンブロット解析しました。Syk Antibody #2712を用いたTotal Sykタンパク質のWBにおいて、両方の細胞集団で適切な分子量の2本のバンドが検出されました。一方、Phospho-Syk (Tyr525/526) (C87C1) Rabbit mAb #2710を用いたリン酸化Sykの解析では、目に見えるバンドは検出されませんでした。SykはPBMCのうちBリンパ球集団でのみ発現し、その中でも一部の集団においてIgM刺激でSykの活性化が起こると考えられます。したがって、IgM処理の効果はタンパク質ライセート内で希釈されてしまい、ウェスタンブロット解析では検出できません。
同じ解析をフローサイトメトリーで行う場合は、B細胞とT細胞特異的マーカー (それぞれ、CD19とCD4) で共染色することでB細胞を区別することができ、CD19陽性かつCD4陰性となるB細胞に絞って、Sykのリン酸化を解析することができます。この場合も、未処理細胞ではSykの活性化はみられませんが、IgM処理後、B細胞のおよそ10%でSykのリン酸化がみられました。このように、フローサイトメトリーでは、ウェスタンブロッティングの場合と異なり、ヒトPBMCの不均一な細胞プールから、Bリンパ球の集団を分離して解析することができます。

CyTOF®マスサイトメトリーを用いた単一細胞プロテオミクスプラットフォームでは、金属標識抗体を使用することで、単一細胞で30以上のタンパク質の同時プロファイルが可能になります。

Cell Signaling Technology (CST) は、CyTOF®マスサイトメーターでの解析に至適化し、厳格に検証したフローサイトメトリー抗体のポートフォリオをPBS溶液で提供しています。

  • PBS保存液のCST™抗体は、CyTOF®機器と、使用する金属標識に最適です。
  • 抗体を高濃度 (> 1 mg/mL) に調製し、標識の効率が改善されています。
  • 何百もの種類がある、フローサイトメトリー検証済みCST™抗体からご選択いただけます。
CyTOF®​で利用可能な抗体についての詳細情報は、カスタムサービスについての記載をご覧くか、カスタムサービスリクエストページからお問い合わせください。
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