InTraSeq™シングルセル解析のよくある質問
質問
- 目的のタンパク質の発現がとても低いのはなぜですか？
- 目的のシグナル伝達経路がすべての細胞で観察されるのなぜですか？
- InTraSeq技術において、メタノール固定ではどのくらいRNAを保存できますか？また、メタノール固定はタンパク質の検出に影響を与えますか？
- InTraSeq実験の後は、10x Genomics社のどの技術やプロトコールを使用すれば良いですか？
- InTraSeq実験により多くの標的を追加したいのですが、カスタム標識抗体を注文できますか？
- シングルセルデータにダブレット/マルチプレットが数多く観察されるのはなぜですか？
- InTraSeqプロトコール後に、細胞がすべて無くなってしまったのはなぜですか？
- InTraSeq実験の前に、他社の標識抗体で免疫染色や細胞のハッシングを行うことはできますか？
- InTraSeqライブラリーでは、1細胞あたり何リードを割り当てるべきですか？
- 抗体カクテルに含まれる抗体量はどれくらいですか？
回答
目的のタンパク質の発現がとても低いのはなぜですか？シングルセルデータセットに含まれるダブレットやマルチプレットが、FeaturePlotでのタンパク質の可視化を阻害する場合があります。最大のカットオフ値 (max.cutoff) を使用することにより、許容範囲外の発現レベルが高いタンパク質を除外し、鮮明な可視化像を取得できます。このような場合は、 「q90」またはより高いパラメーター (「q95」、「q99」など) の使用が適しているかもしれません。以下の太字部分を参照してください：
FeaturePlot(object, features = c("protein_Phospho-S6(Ser235-236)-Ab"), max.cutoff = “q90”, min.cutoff = "q5")
また、発表された論文を読んだり、公開されているデータベースを調べたりして、目的のタンパク質がサンプル中で発現していることを確認し、どのような条件がその発現を変化させる可能性があるかを知ることも重要です。
InTraSeq検証済みでない抗体を使用している場合は、抗体の結合が不十分となり、可視化が阻害される可能性があります。シングルセル実験を行う際は、CST® InTraSeq検証済み抗体を使用し、信頼性と再現性のある確実な結果を取得するためにInTraSeqプロトコールに従ってください。
目的のシグナル伝達経路がすべての細胞で観察されるのなぜですか？シグナル伝達経路に含まれる標的の多くは、普遍的に発現しており、様々な細胞タイプで検出されます。シグナル伝達経路のデータを解析または解釈する際には、適切なコントロール (ノックダウンやノックアウト、刺激、阻害など) を用いて実験をデザインしてください。
FeaturePlotのカラーグラデーションを使用することにより、シングルセルレベルのシグナル伝達経路の解析と解釈がより簡単になります。青 (低発現)、グレー (中発現)、赤 (高発現) を使用した以下の太字部分を参照してください：
FeaturePlot(your_object, features = c("protein_Phospho-CREB(Ser133)-Ab"), max.cutoff = "q95", min.cutoff = "q5") + scale_color_gradientn(colours = c("#003C7B", "#73A9D2", "grey90", "#FDB393", "#b22222"))
InTraSeq技術において、メタノール固定ではどのくらいRNAを保存できますか？また、メタノール固定はタンパク質の検出に影響を与えますか？サンプルは、メタノール固定後そのまま-20°Cの冷凍庫内で最大7日間保存できます。また、CSTの科学者は、すべてのInTraSeq試薬とプロトコールを厳密に検証し、一貫して、確実にRNAが保存できることを確認しています。InTraSeq検証済み試薬用いることにより、不均一性を維持した細胞内の、質の高いRNAシーケンシングの結果を取得できます。InTraSeq用標識抗体とプロトコールは、メタノール固定したサンプルで使用することを前提に開発および検証されており、InTraSeqプロトコールに従うことにより最高の機能を発揮します。
InTraSeq実験の後は、10x Genomics社のどの技術やプロトコールを使用すれば良いですか？弊社のInTraSeq試薬とInTraSeqプロトコールは、10x Genomics Chromiumプラットフォームで使用できるように設計および検証されています。InTraSeqプロトコールの完了後は、10x Genomics社のChromium Single Cell 3'キットを使用してください。詳細は、適切なユーザーガイドをご覧ください：CG000732、CG000317
InTraSeq実験により多くの標的を追加したいのですが、カスタム標識抗体を注文できますか？弊社は、シングルセル解析に使用可能な抗体を含む、CST一次抗体の幅広いカスタム標識抗体およびカスタム標識サービスを提供しています。
オリゴヌクレオチドを用いたカスタム標識抗体は、InTraSeq試薬での使用は検証されていないことに注意してください。InTraSeq技術で使用するカスタム標識抗体の適切なタイトレーションと検証は、オプションで選択できます。
詳細は、カスタム標識抗体とカスタム標識サービスのウェブページをご覧になるか、お近くの販売店にお問い合わせください。
シングルセルデータにダブレット/マルチプレットが数多く観察されるのはなぜですか？メタノール固定バッファーの添加速度は、細胞の凝集に影響を与える可能性があります。InTraSeqプロトコールの細胞固定 (1日目) のステップ7では、氷冷したメタノールをゆっくり (30 秒以上かけて) 滴下することが非常に重要です。 これを行わなかった場合、ダブレットやマルチプレットが生じる可能性があります。
InTraSeqプロトコールの 細胞の洗浄とカウント (3日目) のステップ8終了後も細胞の塊がみられる場合は、シングルセル実験に進む前にさらにピペッティングを行うことを推奨します。
InTraSeqプロトコール後に、細胞がすべて無くなってしまったのはなぜですか？セクションB：ブロッキング (2日目) の開始以降、プロトコールが完了するまで、細胞を850 x g (RPMではありません) で遠心することが重要です。低速での遠心は、細胞の損失につながります。
また、セクションC：免疫染色 (2日目) の開始以降は、どのステップ中であっても、上清を除去する際は細胞ペレットが約40 µLの溶液に浸っていることが重要です。上清をすべて除去しようとすると、細胞を損失する可能性があります。
InTraSeq実験の前に、他社の標識抗体で免疫染色や細胞のハッシングを行うことはできますか？InTraSeq実験の前に、標識抗体やハッシング試薬で生細胞を染色することは可能ですが、推奨しません。InTraSeq試薬を使用する際に、抗体の結合特性が変化する可能性があるため、弊社は、InTraSeq 3’用として検証されていない標識抗体をセクションC：免疫染色 (2日目) で使用することは全く推奨できません。
InTraSeq 3’プロトコールの前に免疫染色ステップを行う場合は、ステップ1で十分な細胞数を確保するために最低200万個の細胞で免疫染色を開始することを強く推奨します。
InTraSeqライブラリーでは、1細胞あたり何リードを割り当てるべきですか？InTraSeqタンパク質ライブラリーのリード数は、1細胞あたり最低でも7,500リードが必要です。
抗体カクテルに含まれる抗体量はどれくらいですか？カクテルに含まれる各抗体は、InTraSeqアッセイでバックグラウンドが最小限となり、確実なシグナルが得られるようにタイトレーションされています。
テクニカルサポート
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Cell Signaling Technology, CST, and InTraSeq are trademarks of Cell Signaling Technology, Inc. All rights reserved. 10x Genomics, 10x, Feature Barcode, and Chromium are the trademarks or registered trademarks of 10x Genomics, Inc. All other trademarks are the property of their respective owners. Visit cellsignal.com/trademarks for more information.
Subject to patents licensed from 10x Genomics, Inc., for use with single-cell (i.e., Chromium) 10x products.