InTraSeq™シングルセル解析の概要

このページでは、InTraSeq技術のより詳細な概要や、この技術がシングルセル解析研究をどのように促進するのかや、弊社が提供する製品ラインナップを紹介します。

以下のリンクを利用し、関心のあるトピックをご覧ください。

従来のシングルセル解析では得られなかった情報を取得

InTraSeqシングルセル解析の特徴と利点

シングルセル解析を最適化

InTraSeqシングルセル解析用の製品ラインナップ

テクニカルサポート

従来のシングルセル解析では得られなかった情報を取得

^{単離したCD4陽性およびCD8陽性の細胞集団を、細胞内および主要なシグナル伝達経路に含まれるタンパク質に対する抗体を用いてInTraSeqで解析し、RNAのみの研究では困難な細胞状態を特定しました。InTraSeqアッセイでは、PTMや細胞内タンパク質の発現レベルをシングルセルレベルで測定することにより、細胞の亜集団に関するさらなる知見が得られます。そのため、疾患の発症機構のより深い理解が可能になります。}

InTraSeq (Intracellular protein and Transcriptomic Sequencing) は、たった1回の実験で、疾患の発症に関わるシグナル伝達経路の特定や分子メカニズムの解明が可能な、CSTが開発したシングルセル解析技術です。この技術は、数千個の細胞におけるRNAと細胞内および細胞表面の両方のタンパク質を同時検出できるため、シングルセルレベルのトランスクリプトームを用いたシグナル伝達経路の調査を可能にします。

InTraSeqの以下の能力により、細胞生物学をより深く理解できます：

• 従来のシングルセルRNAシーケンシング (scRNA-seq) では得られなかった生物学的知見を取得可能
• 転写と翻訳間の動態に着目したシングルセルレベルのデータセットを取得可能
• 翻訳後修飾 (PTM) のシングルセルレベルの定量により細胞シグナル伝達のメカニズムを解明可能

CSTが開発および検証したInTraSeq 3’技術は、10x Genomics社のChromium Single Cell 3' Reagentキットとフィーチャーバーコード標識技術を使用しています。

A) 現在利用可能なシングルセル解析技術の多くは、RNAの検出と、表現型解析用としてバーコード標識抗体を用いた細胞表面タンパク質の測定を行います。B) 多くの企業が、RNAと細胞内タンパク質を同時に検出する方法の開発を試みていますが、これらの方法は通常、RNAの著しい損失と分解が生じます。C) InTraSeq^™シングルセル解析は、細胞内のRNAレベルを維持したまま、RNAと細胞内および細胞表面のタンパク質を検出できます。

現在利用可能なシングルセル解析技術の多くは、RNAのみの検出、できたとしてもRNAと細胞表面マーカーの同時検出であるため、表現型解析に限界があります。さらに、遺伝子発現解析のみのシングルセル解析技術では、疾患状態または薬理学的摂動において活性化される重要なシグナル伝達カスケードの決定および測定は不可能です。InTraSeq技術は、トランスクリプトームやタンパク質、翻訳後修飾の定量を1つのアッセイに統合することにより、たった1回の実験で、表現型解析だけでなく、細胞状態の違いを区別するための細胞メカニズムの解明を可能にします。InTraSeq技術を用いることにより、科学者は、遺伝子発現の変化と共に複数のシグナル伝達経路を容易に探索することできるため、生理学的応答の根底にある主要な分子メカニズムを効率的に特定し、下流のタンパク質修飾を発見できます。

細胞内タンパク質と翻訳後修飾のシングルセル解析 (SCA)

scRNA-seq (scRNA-seq) は通常、薬理学的摂動や環境的摂動への細胞応答の決定に使用されます。しかし、タンパク質の発現量は、必ずしもRNAレベルと直接相関するわけではなく、複雑な生理学的システムの理解を困難にします。シングルセルにおけるタンパク質の発現量と翻訳後修飾のレベルが、遺伝子の発現レベルとはどのくらい異なるのかを決定することにより、scRNA-seqでは得られない、シグナル伝達経路の活性化に関する機能的な知見を取得できます。

翻訳後修飾 (PTM) は、タンパク質の活性や寿命、発現レベルを変化させます。複雑な生物学的システムの根幹にある細胞の不均一性と機能を明らかにするには、遺伝子発現とタンパク質活性の相互作用を理解することが極めて重要です。InTraSeq 3'標識抗体カクテルは、ヒトおよびマウスの両方に結合する、弊社の最も人気の高い31抗体で構成されており、これらにはPTM抗体も含まれます。そのため、科学者は、数十種類もの重要なシグナル伝達タンパク質を、たった1回のアッセイで均一かつ簡単に定量できます。

PTMとmRNAのシングルセルレベルの同時定量

同じRNAレベルを示す細胞でも、最終的なタンパク質の発現量や、薬理学的または環境的な摂動により生じるタンパク質の修飾レベルが異なる場合があります。RNAやタンパク質、翻訳後修飾の同時定量は、RNAレベルだけの解析では解明できない、複雑な生物学的相互作用のより全体的な理解を促進します。

RNAレベルとタンパク質の発現量は必ずしも相関するわけではない

InTraSeqシングルセル解析を用いてmRNAと細胞タンパク質を同時定量した結果から、これらは必ずしも相関するわけではないことが分かります。

InTraSeqシングルセル解析の特徴と利点

合理化されたワークフローで作業時間を短縮可能

簡単な4ステップのプロトコール

InTraSeq^™ 3’Assay Kitは、mRNAとタンパク質の正確なシグナルが、最小限の作業時間で実施可能な簡単なプロトコールで得られるように最適化されています。プロトコールには安全に実験を停止できる便利な停止ポイントが、メタノール固定後最大7日間を含めて2つあるため、実験ワークフローの柔軟性を最大化できます。

InTraSeqのプロトコールでは、作業時間は約1時間であり、複数の停止ポイントが存在するため、シングルセル解析時間の柔軟性を最大化できます。サンプルは、固定ステップ後、RNAの完全性を失うことなく最大7日間保存できます。InTraSeqは、これまでのシングルセル解析プロトコールとは異なり、1日かけて行う長時間のプロトコールのために人員や機器を調整する必要はありません。サンプルの長期保存が可能なため、大量のサンプルの処理やシングルセル解析用の処理のプロトコールを、品質を損なうことなく連日実施することができ、ハイスループットへの応用も容易になります。

簡単な免疫染色プロトコールには、以下のステップが含まれます：

ステップ1：細胞を一晩固定

• 作業時間は5分以内
• 細胞は、冷蔵庫内で最大7日間保存可能

ステップ2：scBlock中でインキュベート

• 作業時間は10分以内
• このステップは、RNAとタンパク質のシングルセルレベルの優れたシグナルが得られるように最適化済み

ステップ3：CST^® InTraSeq^™  3’標識抗体カクテルを添加し、一晩インキュベート

• 作業時間は5分以内

ステップ4：細胞の洗浄

• 作業時間は20分以内
• このステップまで完了したら、細胞をシングルセル10x Genomics 3’実験に使用できます。

正確なRNAシグナルを確保したまま細胞内タンパク質のシグナル伝達を調査可能

シングルセルのマルチオミクス実験におけるRNAの完全性を確保することは、長期にわたる重要な課題です。多くのシングルセル解析では、細胞にとって過酷な条件となる化学薬品を使用して膜を破壊するため、RNAの分解および損失が生じます。InTraSeq試薬は、穏やかに細胞膜と核膜の透過化を行えるように、厳密に最適化されています。これにより、標識抗体は、アッセイ全体にわたりRNAレベルを維持したまま細胞内に侵入して標的に結合できます。そのため、RNAとタンパク質の両方の発現を正確に定量できます。

InTraSeqは、生細胞コントロールと同等レベルの転写産物量をサンプル中に保存可能

^{PMBCの生細胞とInTraSeqで調製したサンプルを定量し、発現している遺伝子の平均値を算出しました。InTraSeq試薬は、PBMCなどの解析が困難な細胞の生細胞における遺伝的プロファイルを保持しており、mRNAの損失を最小限に抑えています。}

均一なカバレッジ深度で検出困難な細胞を特定可能

InTraSeqシングルセル解析技術は、シングルセルレベルの遺伝子発現の解析と並行して細胞内および細胞表面のタンパク質の両方を検出および定量し、不均一な細胞集団を細分化する能力により成立します。細胞表面タンパク質のみを検出するCITE-Seqとは対照的に、InTraSeqは、複雑な細胞内シグナル伝達経路を均一に研究するためのツールを科学者に提供します。

InTraSeqは細胞の不均一性を維持

InTraSeqプロトコール実施前後での、同じドナーから得られたPBMC集団に含まれる細胞タイプをUMAPで解析しました。2つのUMAPプロット図から、各細胞タイプの割合は同等であり、InTraSeqプロトコールの影響を受けていないことが分かります。

1回の実験で複数の分子メカニズムを探索可能

細胞内シグナル伝達と翻訳後修飾用の抗体に関するCSTの知識とInTraSeq技術を組み合わせることにより、研究者は、細胞内や核内、細胞表面のタンパク質の複雑な相互作用と遺伝子発現を同時に研究して定量することができます。トランスクリプトミクスの変化と翻訳後修飾を含むタンパク質の発現の同時測定は、他のアッセイでは得られない、複雑なシグナル伝達システムの知識に富んだより包括的なデータセットの作成を可能にし、疾患の発症機序への理解を深めることができます。

細胞内タンパク質のシングルセルレベルの解析データを用いたCD4陽性およびCD8陽性の細胞集団における細胞状態の特定

^{単離したCD4陽性およびCD8陽性の細胞集団を、細胞内および主要なシグナル伝達経路に含まれるタンパク質に対する抗体を用いてInTraSeqで解析し、RNAのみの研究では困難な細胞状態を特定しました。InTraSeqアッセイでは、PTMや細胞内タンパク質の発現レベルをシングルセルレベルで測定することにより、細胞の亜集団に関するさらなる知見が得られます。そのため、疾患の発症機構のより深い理解が可能になります。}

InTraSeq 3'標識抗体カクテルには、2種類の細胞表面タンパク質と、29種類のPTMを含む細胞内タンパク質を標的とする、合計31種類の検証済み抗体が含まれます。この抗体カクテルは、免疫学やがん研究で日常的に調査されるシグナル伝達経路に沿ったタンパク質の均一な定量ができるように設計されており、正確で信頼性の高いデータセットを提供します。

^{LPSで刺激したPBMCをInTraSeq™アッセイキットで調製し、RNAやトータルタンパク質、PTMを、scRNA-seqとInTraSeq™ 3'標識抗体カクテルを用いて定量しました。このヒートマップは、刺激前後のStat3とMAPKのPTMレベルと、リン酸化レベルの変化と相関するRNAとタンパク質の発現レベルを示しています。}

シングルセル解析を最適化

InTraSeqは、新たなプロジェクトを開始する際の、独特で強力なスクリーニングツールとなります。この技術は、どのシグナル伝達経路が変化しているかを特定し、どこに焦点を当てるべきかを決定するのに役立つ、均一なアプローチを提供できるため、研究者は、特定の遺伝的表現型を理解できます。

また、PTM応答はmRNA合成よりも先に起こるため、InTraSeqは、短時間 (20分未満) に生じる急性の細胞障害も測定できます。このような急性の応答は、他のRNAのシングルセル解析では測定できないため、いかにInTraSeq技術が重要であり独特であるかが分かります。

細胞内タンパク質を用いたサンプルマルチプレックス解析の精度向上

シングルセル解析におけるサンプルマルチプレックスとは、シングルセル実験の前に、細胞表面タンパク質または細胞内タンパク質を用いて複数のサンプルを個別に標識する技術です。これにより、シングルセルRNA-seq実験の回数を最小限に抑え、実験スループットを向上させることができるため、コストと時間の両方を節約できます。また、バッチ間のばらつきを低減することで、再現性の高いデータを生成します。

Histone H3は、InTraSeqサンプルのマルチプレックス化に用いられる細胞に普遍的に発現する核タンパク質であり、図1に示すように、細胞表面タンパク質を用いたサンプルよりも高い特異性を示し、デマルチプレックスプロセスを促進する効率的なサンプルマルチプレックスプロトコールの作成に役立ちます。

図1：他社の細胞表面タンパク質抗体またはCSTの細胞内タンパク質抗体でマルチプレックス化したInTraSeqサンプルの比較

A) アノテーションされたサンプル1とサンプル2のUMAPプロットを示しています。B) ハッシュ抗体で検出した細胞表面タンパク質発現レベルのFeaturePlotを示しています。未標識のサンプル2に、非特異的なシグナルがみられます。 C) Histone H3 (D1H2) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq™ 3' Conjugate 3048) で検出した細胞内タンパク質発現レベルのFeaturePlotを示しています。シグナルは、予測通りサンプル1に特異的です。

未標識のサンプル2における、サンプル1に特異的な細胞表面タンパク質の発現 (左) とHistone H3 (D1H2) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq^™ 3’Conjugate 3048) の発現 (右) を比較するViolinプロットを示しています。

シングルセルレベルでのCAR発現細胞の特定が可能

キメラ抗原受容体 (CAR) T細胞療法とは、生体内の免疫系を活用して抗腫瘍効果を誘導する療法であり、大きな期待が寄せられています。多くのscFvベースのCARが、G4SリンカーまたはWhitlow/218リンカーのいずれかの繰り返し配列を含むため、非常に特異性の高い抗CARリンカー抗体は、細胞表面に発現するあらゆるscFvベースのCARをモニタリングできます。

シングルセル解析用のWhitlow/218リンカー (E3U7Q) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq^™ 3’Conjugates 3053) は、シングルセルレベルでのCAR発現細胞の検出や、複数のシグナル伝達経路の同時解析を可能にするため、基礎的な生物学を明らかにできます。

形質導入されていないT細胞、またはWhitlow/218リンカーを含有するscFvベースの抗BCMA (C11D5.3) CARで形質導入されたT細胞を、InTraSeq^™ 3’プロトコールに従って処理しました。A) アノテーションされた細胞集団のUMAPプロットを示しています。B) Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq^™ 3' Conjugate 3053) #50265の発現を示しています。C) {URL/Link}遺伝子導入していないT細胞またはWhitlow/218リンカーを含有するscFvベースのAnti-BCMA (C11D5.3) CARを遺伝子導入したT細胞を、Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit Monoclonal Antibody (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #69310を用いてフローサイトメトリーで解析し、交差検証しました。

CAR改変細胞の特性解析用のソリューションにアクセスして、CSTが提供するCARリンカー抗体やキット、サービスの詳細をご覧ください。

CSTの検証済みInTraSeq^™ 3'標識抗体カクテルで信頼できる結果を取得

CSTの科学者は、お客様が一貫性のある質の高い結果を取得できるように、すべてのInTraSeq抗体と試薬を厳密に検証および最適化しています。InTraSeq^™ 3'標識抗体カクテルは、含まれるすべての抗体と試薬が最適な濃度になるように調製されており、すぐに実験に使用可能です。InTraSeqを用いることにより、科学者は、時間のかかる最適化実験を行うことなく、信頼できるデータを取得できます。

InTraSeqシングルセル解析用の製品ラインナップ

下記よりお客様のワークフローに適したソリューションを見つけてください。

InTraSeq^™ 3'標識抗体カクテル

InTraSeq^™ 3'標識抗体カクテルには、一般的なシグナル伝達経路に含まれるタンパク質に対する様々な一次抗体が同梱されています。特別な組成で提供されており、自由自在に混合してより広範にわたるお好みのカクテルを簡単に作製できます。これらのカクテルはすべて、ヒトおよびマウスの両方のサンプルに反応します。

• InTraSeq^™ 3’ Conjugate Antibody Cocktail 1：31種類の一次抗体

• InTraSeq^™ 3’ Conjugate Antibody Cocktail 2：32種類の一次抗体

• InTraSeq™ 3’ Conjugate Antibody Cocktail 3：32種類の一次抗体

テクニカルサポート

テクニカルサポートページで、InTraSeqシングルセル解析に関連するトラブルシューティング情報や技術的な質問への回答、弊社へのお問い合わせ方法をご覧ください。

^{Cell Signaling Technology, CST, and InTraSeq are trademarks of Cell Signaling Technology, Inc. All rights reserved. 10x Genomics, 10x, Feature Barcode, and Chromium are the trademarks or registered trademarks of 10x Genomics, Inc. Alexa Fluor is a registered trademark of Life Technologies Corporation. All other trademarks are the property of their respective owners. Visit cellsignal.com/trademarks for more information.}

^{Subject to patents licensed from 10x Genomics, Inc., for use with single cell (i.e., Chromium) 10x products.}