Nanog (D2A3) XP^® Rabbit mAb #8822

クロマチン免疫沈降

SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005の専用プロトコールです。

必要な試薬

キットに含まれている試薬：

1. Glycine Solution (10X) #7005
2. Buffer A (4X) #7006
3. Buffer B (4X) #7007
4. ChIP Buffer (10X) #7008
5. ChIP Elution Buffer (2X) #7009
6. 5 M NaCl #7010
7. 0.5 M EDTA #7011
8. ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006
9. DNA Binding Buffer #10007
10. DNA Wash Buffer #10008 (4倍量のエタノールを使用前に加えてください)
11. DNA Elution Buffer #10009
12. DNA Purification Columns and Collection Tubes #10010
13. Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012
14. RNAse A (10 mg/ml) #7013
15. Micrococcal Nuclease #10011
16. Proteinase K (20 mg/ml) #10012
17. SimpleChIP^® Human RPL30 Exon 3 Primers 1 #7014
18. SimpleChIP^® Mouse RPL30 Intron 2 Primers 1 #7015
19. Histone H3 (D2B12) XP^® Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620
20. Normal Rabbit IgG #2729
21. DTT (Dithiothreitol) #7016

キットに含まれない試薬：

1. Magnetic Separation Rack #7017 / 14654
2. Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2 (Sterile) #9872
3. Nuclease-free Water #12931
4. エタノール (96 - 100%)
5. ホルムアルデヒド (37%ストック溶液)
6. SimpleChIP^® Universal qPCR Master Mix #88989

I. 組織のクロスリンクおよびサンプル調製

組織を採取する際、脂肪や壊死組織などの不要な部分を取り除きます。組織サンプルはすぐに使用して直ちにクロスリンクするか、次に使用するまでドライアイスで凍結して-80℃で保存してください。最適なクロマチン収量とChIP結果を得るため、各免疫沈降あたり25 mgの組織を使用します。クロマチン収量は組織の種類により異なるため、一部の組織では各免疫沈降あたり25 mgを超える量が必要となります。組織ごとに予測されるクロマチン収量については、Appendix Aを参照してください。クロマチンの断片化および濃度の解析 (セクションIV) のためにクロマチンサンプルを1本余分に用意してください。必要に応じて5本のクロマチンサンプルを追加で用意し、クロマチン断片化の最適化 (Appendix B) で使用します。

実験開始前の準備：

(!) すべてのバッファーの量は、免疫沈降 (IP prep) のサンプル数に応じて比例的に増やす必要があります。

• 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) と10X Glycine Solutionを取り出し、室温に戻してください。PICが完全に溶けていることを必ず確認してください。
• 25 mgの組織に対して、Phosphate Buffered Saline (PBS) 3​​ mL + 200X PIC 15​​ μLの混合液を調製して、氷上に置いてください。
• 25 mgの組織に対して、37%ホルムアルデヒド45 μLを用意し、室温に置いてください。使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。

A. クロスリンク

1. 新鮮組織または凍結組織サンプルを計量してください。免疫沈降1回あたり、25 mgの組織を使用します (ポジティブおよびネガティブコントロールも含めると、1回の実験で少なくとも75 mgの組織が必要です)。
2. 組織サンプルを60 mmまたは100 mmのディッシュに置き、清潔な解剖用メスまたは剃刀の刃で細かく切り刻んでください。シャーレは氷上に置いてください。タンパク質分解を防ぐため、組織をよく冷やす必要があります。
3. ミンスした組織を、15 mLのコニカルチューブに移してください。
4. 25 mgの組織に対し、PBS + PIC混合液1 mLを加えてください。
5. タンパク質をDNAにクロスリンクするため、PBS + PIC混合液1 mLに対し、37%のホルムアルデヒド 45 μLを加え、室温で20分間振盪させてください。ホルムアルデヒドの終濃度は1.5%です。
6. PBS + PIC混合液1 mLに対して10X Glycine 100 μLを加えてクロスリンクを止め、5分間室温で混和してください。
7. 組織をベンチトップ遠心分離機を用いて、4℃、500​ x gで5分間遠心分離してください。
8. 上清を取り除き、25 mgの組織に対しPBS + PIC混合液1 mLで一度洗ってください。
9. ベンチトップ遠心分離機を用いて、4℃、500​ x gで5分間、再度遠心分離してください。
10. 上清を取り除き、25 mgの組織に対しPBS + PIC混合液1 mLで再懸濁し、氷上に置いてください。Medimachine (B) あるいはDounce Homogenizer (C) を用いて組織をバラバラにし、単細胞懸濁液を調製してください。(​​SAFE STOP​) もしくは、破砕する前のサンプルを-80℃で3ヵ月まで保存することができます。

B. Medimachine (BD Biosciences：part #340587) を用いた組織破砕

1. 1000 μLピペットチップの先を切って穴を広げ、組織の塊が通るようにしてください。
2. PBS + PIC混合液1 mLに再懸濁した組織サンプルを、50 mm Medicone (part #340592) の上部チャンバーに移してください。
3. メーカーの推奨手順に従い、組織を2分間すり潰してください。
4. 1 mLのシリンジと先の鈍い18ゲージの注射針を用いて、Mediconeの一番下のチャンバーから細胞懸濁液を集めてください。細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移し、氷上に置いてください。
5. 組織全体がすり潰されて均質な懸濁液になるまで、ステップ2-4を繰り返してください。
6. さらにすり潰す必要がある場合、組織サンプルにPBS + PIC混合液を追加してください。組織全体がすり潰されて均質な懸濁液になるまで、ステップ2-5を繰り返してください。
7. 顕微鏡で単細胞懸濁液であることを確認してください (オプション)。
8. ベンチトップ遠心分離機を用いて、細胞を4℃、2,000​ x gで5分間遠心分離してください。
9. 上清を取り除き、続けて細胞核の調製とクロマチン断片化 (セクションIII) に進んでください。

C. Dounce Homogenizerを用いた組織破砕

1. PBS + PIC混合液に再懸濁した組織をDounce Homogenizerに移してください。
2. 20-25回ストロークで組織を破砕します。顕微鏡で単細胞懸濁液であることを確認してください (オプション)。
3. 細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移し、ベンチトップ遠心分離機を用いて4℃、2,000​ x gで5分間遠心分離してください。
4. 上清を取り除き、続けて細胞核の調製とクロマチン断片化 (セクションIII) に進んでください。

II. 培養細胞のクロスリンクおよびサンプル調製

最適なChIPの結果を得るため、各免疫沈降に対し約4​ x 10⁶個の細胞を使用します。ポジティブコントロールとネガティブコントロールを含めると、少なくとも12​ x 10⁶個の細胞が必要です。HeLa細胞の場合、免疫沈降1回分は増殖培地20 mLで90​%コンフルエントに培養した15 cmディッシュの半分量に相当します。クロマチンサンプルを1本余分に用意し、クロマチンの断片化および濃度についての解析に使用します (セクションIV)。さらに、細胞種ごとに培養ディッシュを1枚余分に用意し、血球計算盤またはセルカウンターを用いて細胞数を計測することを推奨します。

実験開始前の準備

(!) 全てのバッファーの量は、使用する15 cmの組織培養ディッシュ (または20 mLの浮遊細胞) の枚数に応じて、比例的に増やす必要があります。

• 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012と10X Glycine Solution #7005を取り出し、室温に戻してください。PICが完全に溶けていることを必ず確認してください。
• 15 cmディッシュ1枚 (または浮遊細胞20 mL) あたり、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2 mL + 200X PIC 10 μLを調製して、氷上に保持してください。
• 15 cmディッシュ1枚 (または浮遊細胞20 mL) あたり、PBS 40 mLを調製し、氷上に保持してください。
• 15 cmディッシュ1枚 (または浮遊細胞20 mL) あたり、37%ホルムアルデヒド540 µLを用意し、室温に戻してください。使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。

1. タンパク質をDNAにクロスリンクするために、20 mLの培地を入れた15 cm培養ディッシュに対して、37%ホルムアルデヒド540 μLを加えてください。浮遊細胞の場合は、37%ホルムアルデヒド540 μLを20 mLの培地に懸濁した細胞に加えてください (浮遊細胞を適切にクロスリンクするため、細胞密度は0.5 x 10⁶細胞/mL未満に調整してください)。手早くディッシュを傾けて混ぜ合わせ、室温で10分間インキュベートしてください。最終的なホルムアルデヒド濃度は1%です。ホルムアルデヒドを加えると、培地の色が変化することがあります。
2. 10X Glycine Solution 2 mLを、培地が20 mL入ったそれぞれの15 cmディッシュに加え、手早く回して混ぜ合わせ、室温で5分間インキュベートしてください。glycineを加えると、培地の色が変化することがあります。
3. 浮遊細胞の場合は、細胞を50 mLのコニカルチューブに移し、4℃で500​ x g、5分間遠心分離し、ペレットを氷冷したPBS 20 mLで2度洗ってください。上清を取り除き、直ちに核の調製とクロマチンの断片化 (セクションII) に進んでください。
4. 接着細胞の場合は、培地を取り除き、細胞を氷冷した1X PBS 20 mLで2回洗ってください。毎回、洗いの液を完全に取り除いてください。
5. 氷冷したPBS + PIC混合液2 mLを、それぞれの15 cmのディッシュに加えてください。細胞を掻き取り、バッファーに懸濁してください。すべてのディッシュから集めた細胞をコニカルチューブ (15 mL) 1本に集めてください。
6. ベンチトップ遠心分離機を用いて、細胞を2,000​ x gで5分間、4℃で遠心分離してください。上清を取り除き、直ちに核の調製とクロマチンの断片化 (セクションII) に進んでください。(​​SAFE STOP​) この状態で、サンプルを-80℃で3ヵ月まで保存できます。

III. 核の調製とクロマチンの断片化

実験開始前の準備

(!) すべてのバッファーの量は、免疫沈降 (IP prep) のサンプル数に応じて比例的に増やす必要があります。

• 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012を取り出し、室温に戻してください。使用前に完全に解凍されていることを確認してください。
• 1 M DTT (DTT #7016 192.8 mg + 精製水 (dH₂O) 1.12 mL) を調製します。DTTの結晶が完全に溶解されていることを確認してください。

  (!!) 重要：溶解したら、1M DTTは-20℃で保存してください。

• 10X ChIP Buffer #7008を取り出して室温に戻し、SDSが完全に溶解していることを確かめてください。
• IP prepにつき、1X Buffer A 1 mL (4X Buffer A #7006 250 μL + 水750 μL) + 1M DTT 0.5 μL + 200X PIC 5 μL混合液を調製し、氷上に保持してください。
• IP prepにつき、1X Buffer B ​1.1 mL (4X Buffer B #7007​​ 275 μL + 水825 μL) + 1M DTT 0.55 μL混合液を調製し、氷上に置いてください。
• IP prepにつき、1X ChIP Buffer ​100 μL (10X ChIP Buffer #7008 10 μL + 水90 μL) + 200X PIC 0.5 μL混合液を調製し、氷上に保持してください。。

1. 細胞を、氷冷した1X Buffer A + DTT + PIC混合液1 mL (IP prepにつき) に再懸濁してください。氷上で10分間インキュベートしてください。3分ごとに、チューブを転倒混和してください。
2. ベンチトップ遠心分離機を用いて2,000​ x gで5分間、4℃で遠心分離し、細胞核を沈殿させてください。上清を取り除き、氷冷した1X Buffer B + DTT混合液1 mL (IP prepにつき) でペレットを再懸濁してください。再度遠心分離して上清を取り除き、ペレットを1X Buffer B + DTT混合液100 µL (IP prepにつき) に再懸濁してください。1.5​ mLの微量遠心分離用チューブに移してください (チューブ1本あたり最大1 mLまで)。
3. IP prepにつき、Micrococcal Nuclease #10011​ 0.5 μLを加え、数回転倒混和してください。37℃で20分間頻繁に混和しながらインキュベートし、約150-900 bpの長さにDNAを断片化してください。3-5分ごとに転倒混和してください。DNAを最適なサイズに断片化するために必要なMicrococcal Nucleaseの量は、各組織および細胞株の検討結果に基づいて決定しなければならない場合があります (Appendix B参照)。HeLaの細胞核の場合、​4 x 10⁶個の細胞につきMicrococcal Nuclease 0.5 μL、マウス肝臓の場合、25 mgの組織につきMicrococcal Nuclease 0.5 μLを処理すると、適切なサイズのDNA断片に断片化できます。
4. IP prepにつき、0.5 M EDTA #7011 10 µLを加えて断片化を停止し、1-2分間氷上に置いてください。
5. 16,000​ x gで1分間、4℃で遠心分離して細胞核を沈殿させ、上清を除去してください。
6. 核ペレットを、IP prepにつき1X ChIP Buffer + PIC混合液100 μLで再懸濁し、氷上で10分間インキュベートしてください。
7. 1.5 mLの遠心分離用チューブに、1本あたり最大500 μLまでのライセートを入れ、2、3回ソニケーション処理を行うことで核膜を壊してください。ソニケーション処理の合間に、サンプルを30秒間氷水に浸してください。細胞核を完全に溶解するために必要な最適条件は、ソニケーション処理の前後に細胞核を光学顕微鏡で観察することで決定できます。VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator (1/8-inch probe) の場合、6に設定し、20秒間のソニケーション処理を3​セット行うことで、HeLa細胞の核は完全に破砕されます。代わりに、Dounce Homogenizerで20回ホモジェナイズしても細胞核を破砕できますが、破砕が不完全になる可能性があります。
8. 9,400​ x gで10分間、4°Cで遠心分離して、ライセートを清澄化してください。
9. 上清を新しいチューブに移してください。(​​SAFE STOP​) これがクロスリンクしたクロマチン調製液です。使用するまで‐80℃で保存してください。50 μLのクロマチン調製液を、クロマチンの断片化および濃度の解析 (セクションIV) に使用します。このサンプル50 µLは-20℃で一晩保存しても構いません。

IV. クロマチンの断片化および濃度の解析 (推奨ステップ)

1. クロマチンサンプル 50 μL (セクションIIIのステップ9) に、Nuclease-free water 100 μL、5 M NaCl #7010 6 μL、およびRNAse A #7013 2 μLを加えてください。ボルテックスで混和し、37℃で30分間インキュベートしてください。
2. RNase Aで処理した各サンプルに、Proteinase K 2 μLを加え、ボルテックスにより混和し、65℃で2時間インキュベートしてください。
3. セクションVIIに記載されているとおり、DNA精製用スピンカラムを用いてDNAをサンプルから精製してください。(​​SAFE STOP​) DNAは-20℃で6ヵ月まで保存することができます。
4. DNA精製後、各サンプル10 μLを、100 bpのDNAマーカーとともに1%アガロースゲルで電気泳動し、DNA断片のサイズを測定してください。DNAが約150-900 bp (1-5​個のヌクレオソーム、図1参照) のサイズに断片化されているはずです。
5. DNA濃度を測定するため、精製したDNA 2 μLをNuclease-free water 98 μLに入れて50倍希釈し、OD₂₆₀を記録してください。原液のDNA濃度 (μg/mL) は、OD₂₆₀ x 2,500となります。理想的なDNA濃度は50-200 μg/mLです。

注意：最適なChIPの結果を得るためには、クロマチンのサイズと濃度を適切にすることが非常に重要です。クロマチンを断片化しすぎると、定量PCRのシグナルが消失する可能性があります。一方で、クロマチンの断片化が不十分な場合、バックグラウンドシグナルが上昇し分解能が低下します。また、免疫沈降に用いるクロマチン量が少なすぎると、定量PCRのシグナルが低下する原因になります。クロマチンの断片化を最適化するためのプロトコルは、Appendix Bに記載されています。

V. クロマチン免疫沈降 (ChIP)

最適なChIPの結果を得るため、免疫沈降1回あたり約5-10 μgの断片化されたクロスリンククロマチン (セクションIVに記載) を使用してください。これは、25 mgの破砕した組織あるいは4​ x 10⁶​個の培養細胞から調製された免疫沈降サンプル100 μL分に概ね相当します。一般的には、抗体を加える前にクロマチンサンプル100 μLを1X ChIP Buffer 400 μLで希釈しますが、免疫沈降1回あたり100 μL以上必要な場合は下記のようにクロマチンサンプルを希釈する必要はありません。希釈しない場合も、クロマチンサンプルに直接抗体を加えることでクロマチン複合体の免疫沈降ができます。

実験開始前の準備

(!) すべてのバッファーの量は、免疫沈降の回数に応じて比例的に増やす必要があります。

• 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012を取り出し、室温に戻してください。PICが完全に溶けていることを必ず確認してください。
• 10X ChIP Buffer #7008を取り出して室温に戻し、SDSが完全に溶解していることを確かめてください。
• 断片化したクロマチン調製液 (セクションIIIのステップ9から) を解凍し、氷上で解凍します。
• Low salt washの調製：免疫沈降1回につき、1X ChIP Buffer (10X ChIP Buffer #7008 300 µL + 水2.7 mL) 3 mL。使用するまで室温で保持してください。
• High salt washの調製：免疫沈降1回につき、1X ChIP Buffer (10X ChIP Buffer #7008 100 µL + 水900 µL) 1 mL + 5 M NaCl #7010 70 µL。使用するまで室温で保持してください。

1. 1本のチューブに、予定の免疫沈降回数分の消化クロマチンを調製する希釈操作に十分な量の1X ChIP Bufferを用意します：免疫沈降1回につき、1X ChIP Buffer (10X ChIP Buffer 40 µL + 水360 µL) 400 µL + 200X PIC <ut>2</ut> µL。免疫沈降のサンプル数を決定する時には、ポジティブコントロールのHistone H3 (D2B12) XP^® Rabbit mAb #4620およびネガティブコントロールのNormal Rabbit IgG Antibody #2729​​のサンプルを数に含めてください。調製したチューブを氷上に保持してください。
2. 調製した1X ChIP Bufferへ、断片化とクロスリンクをしたクロマチン調製液 (セクションIIIのステップ9) を免疫沈降1回あたり100 μL (5-10 μgのクロマチンに相当する量) 加えます。例えば、10​回分の免疫沈降では、1X ChIP Buffer 4 mL (10X ChIP Buffer 400 μL + 水3.6 mL) + 200X PIC 20 μL + 断片化したクロマチン調製液1 mLを入れたチューブを1本調製してください。
3. 希釈したクロマチン10 μLを遠心分離用チューブに移してください。これが2%インプットサンプルです。使用するまで-20℃で保存してください (セクションVIのステップ1で使用します)。
4. 免疫沈降ごとに、断片化したクロマチン500 μLを1.5 mLの遠心分離用チューブに分注し、免疫沈降用抗体を加えてください。必要な抗体量は免疫沈降ごとに異なりますので、お客様ご自身で決定する必要があります。ポジティブコントロールのHistone H3 (D2B12) XP^®​Rabbit mAb #4620については、10 μLを免疫沈降サンプルに加えてください。ネガティブコントロールのNormal Rabbit IgG #2729については、1-2 μL (1-2 μg) を免疫沈降サンプルに加えます*。CST抗体を用いる場合は、データシートまたは製品のウェブページに記載されている希釈率を参照し、対照比較のためにCST抗体の濃度に基づいてネガティブコントロールのIgG抗体の量 (μg) を算出してください。ローテーターを用いて、免疫沈降サンプルを4℃で4時間から一晩インキュベートしてください。

   注意：Cell Signaling Technologyのほとんどの抗体は、免疫沈降1回あたり1-2 µgを使用することで適切にワークします。濃度の異なる複数の抗体がある場合は、最も高い抗体濃度にネガティブコントロールNormal Rabbit IgG #2729の濃度を合わせて使用することをお勧めします。

5. ChIP Grade Protein G Magnetic Beads #9006を穏やかにボルテックスし、再懸濁してください。直ちにProtein G Magnetic Beads 30 μLをそれぞれの免疫沈降反応液に加え、ローテーターを用いて、4℃で2時間インキュベートしてください。
6. 各免疫沈降ごとにチューブをMagnetic Separation Rack #7017にセットし、Protein G Magnetic Beadsを分離させてください。溶液が澄むまで1-2分間待ち、上清を注意深く取り除いてください。
7. low salt wash 1 mLをBeadsに加えてProtein G Magnetic Beadsを洗い、4℃で5分間ローテーターを用いてインキュベートします。ステップ6と7を更に2回繰り返し、計3回low salt washで洗ってください。
8. high salt wash 1 mLをBeadsに加え、4℃で5分間ローテーターを用いてインキュベートしてください。
9. 各免疫沈降ごとにチューブをMagnetic Separation Rackにセットし、Protein G Magnetic Beadsを分離させてください。溶液が澄むまで1-2分間待ち、上清を注意深く取り除いてください。直ちにセクションVIに進んでください。

VI. 抗体/Protein G Magnetic Beadsからのクロマチンの溶出および脱クロスリンク

実験開始前の準備

(!) すべてのバッファーの量は、免疫沈降の回数に応じて比例的に増やす必要があります。

• 37℃のウォーターバスで2X ChIP Elution Buffer #7009を温め、SDSが完全に溶解していることを確認してください。
• 水浴またはサーモミキサーを65℃に設定してください。
• 各免疫沈降サンプルおよび2%インプットサンプルごとに、1X ChIP Elution Buffer 150 μL (2X ChIP Elution Buffer #7009 75 μL+ 水75 μL) を用意してください。

1. 1X ChIP Elution Buffer 150 μLを、2%インプットサンプル入りのチューブに加え、ステップ6で使用するまで室温に置いておきます。
2. 1X ChIP Elution Buffer 150 μLを、それぞれの免疫沈降サンプルに加えてください。
3. 静かにボルテックス (1,200 rpm) しながら、65℃で30分間処理し、抗体/Protein G Magnetic Beads複合体からクロマチンを溶出してください。本ステップには、サーモミキサーの使用をお勧めします。代わりにローテーターを用いて室温で溶出することもできますが、完全に溶出されない可能性があります。
4. チューブをMagnetic Separation Rackにセットし、液が澄むまで1-2分間待ち、Protein G Magnetic Beadsを分離させてください。
5. 溶出されたクロマチンを含む上清を、注意深く新しいチューブに移してください。
6. ステップ1で調製した2%インプットサンプルを含むすべてのチューブに、5M NaCl 6 μLおよびProteinase K #10012​ 2 μLを加えて65℃で2時間インキュベートし、脱クロスリンクしてください。インキュベーションは一晩まで延長することができます。
7. 直ちにセクションVIIに進んでください。(​​SAFE sTOP​) もしくは、サンプルは-20℃で4​日間まで保存できます。ただし、沈殿物の形成を防ぐために、DNA Binding Buffer #10007を加える前に (セクションVIIのステップ1)、必ずサンプルを室温に戻してください。

VII. スピンカラムを用いたDNAの精製

実験開始前の準備

• (!!) 使用前に、エタノール (96 - 100%) 24 mLをDNA Wash Buffer #10008​​に加えてください。このステップは、DNA精製の最初のセッティングの前に1度だけ実施してください。
• セクションVで得られた各DNAサンプルに対し、DNA Purification collection tube #10010​​を一つずつ用意してください。

1. DNA Binding Buffer #10007​ 750 μLを各DNAサンプルに加え、軽くボルテックスしてください。
   • 1サンプルあたり5倍量のDNA Binding Bufferを使用します。
2. ステップ1のサンプル450 μLを、コレクションチューブにセットしたDNAスピンカラムに移してください。
3. 18,500​ x gで30秒間遠心分離してください。
4. コレクションチューブからスピンカラムを取り外し、液体を廃棄してください。スピンカラムをコレクションチューブに再セットしてください。
5. ステップ1で残った各サンプル450 μLを、コレクションチューブにセットしたスピンカラムに移してください。ステップ3と4を繰り返してください。
6. DNA Wash Buffer #10008 750 μLを、コレクションチューブにセットしたスピンカラムに加えてください。
7. 18,500​ x gで30秒間遠心分離してください。
8. コレクションチューブからスピンカラムを取り外し、液体を廃棄してください。スピンカラムをコレクションチューブに再セットしてください。
9. 18,500​ x gで30秒間遠心分離してください。
10. コレクションチューブと液体を廃棄してください。スピンカラムは廃棄しないでください。
11. DNA Elution Buffer #10009 50 μLを各スピンカラムに加え、新しい1.5 mLの遠心分離用チューブにセットしてください。
12. 18,000​ x gで30秒間遠心分離して、DNAを溶出してください。
13. DNAスピンカラムを取り外し、廃棄してください。得られた溶出液が精製されたDNAです。(​​SAFE STOP​) サンプルは-20℃で保存することができます。

VIII. PCRによるDNAの定量

推奨される対処法

• コンタミネーションを防ぐため、ピペットチップはフィルター付きのものを使用してください。
• キットに含まれているコントロールプライマーは、ヒトとマウスのRPL30遺伝子 (#7014​と#7015) に特異的で、通常のPCRまたは定量的リアルタイムPCRのどちらにも使用することができます。他の動物種でChIPを実施する場合は、その種で使用可能な適切なプライマーを設計し、最適なPCR条件を決定してください。
• 非特異的なPCR産物の増幅を防ぐため、ホットスタート用Taqポリメラーゼの使用を推奨します。
• プライマーの設定は非常に重要です。以下の条件に近いプライマーを設計してください:

プライマーの長さ：	24塩基
Tm：	60°C
GC：	50%
アンプリコンのサイズ：	150-200 bp (通常のPCR)
	80-160 bp (定量的リアルタイムPCR)

通常のPCR：

1. 0.2 mLのPCRチューブに適切な番号をラベルしてください。2%インプットサンプル、ポジティブコントロールのHistone H3サンプル、ネガティブコントロールのNormal Rabbit IgGサンプル、およびDNAコンタミネーションに対するコントロールとしてDNAなしのチューブを用意してください。
2. 各チューブにDNAサンプル2 μLを分注してください。
3. 分量不足を防ぐために、実際のチューブの本数に2本追加した量を全体量として、マスターミックスを下記の通りに調製してください。各反応用チューブにマスターミックス18 μLを加えてください。

試薬	PCR反応1回分の分量 (18 μL)
Nuclease-free H2O	12.5 µL
10X PCR Buffer	2.0 µL
4 mM dNTP Mix	1.0 µL
5 µM RPL30 プライマー	2.0 µL
Taq DNA Polymerase	0.5 µL

4. PCR反応を以下のプログラムで開始してください：

a.	初期変性	95℃	5分間
b.	変性	95℃	30 秒間
c.	アニーリング	62℃	30 秒間
d.	伸長反応	72℃	30 秒間
e.	ステップb-dを繰り返し、計34サイクル反応させてください。
f.	最終伸長反応	72℃	5分間

5. 反応終了後、100 bpのDNAマーカーとともに、各PCR産物10 μLを2%アガロースゲルまたは10%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動してください。予想されるPCR産物のサイズは、Human RPL30 #7014では161 bp、Mouse RPL30 #7015では159 bpです。

定量的リアルタイムPCR：

1. 使用するPCR装置のモデルに対応するPCRチューブあるいはPCRプレートに、適切なサンプル番号を記載してください。PCR反応には、ポジティブコントロールのHistone H3サンプル、ネガティブコントロールのNormal Rabbit IgGサンプル、DNAコンタミネーション確認用のコントロールとしてDNAを含まないチューブ、および標準曲線の作成と増幅効率の決定のため2%インプットクロマチンDNAの段階希釈サンプル (希釈なし、1：5、1：25、1：125) を用意してください。
2. PCRチューブあるいはPCRプレートのウェルに、適切なDNAサンプル2 μLを加えてください。
3. 以下のように、マスターミックスを調製してください。分量不足を考慮して、実際のチューブの本数に2本追加した量を全体量として、調製してください。各PCRチューブあるいは各ウェルにマスターミックス18 μLを加えてください。(​​SAFE STOP​) 必要に応じて、遮光のためアルミホイルでプレートを覆い、4℃の場合は4時間まで、また-20℃の場合は一晩、装置が使用できるようになるまで保存してください。

試薬	PCR反応1回分の分量 (18 μL)
Nuclease-free H2O	6 µL
5 µM RPL30 プライマー	2 µL
SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989	10 µL

4. PCR反応を以下のプログラムで開始してください：

a.	初期変性	95℃ 3分間
b.	変性	95℃ 15秒間
c.	アニーリングおよび伸長：	60℃ 60秒間
d.	ステップb - cの繰り返し (合計40サイクル)

5. リアルタイムPCR装置に付属のソフトウェアを使用して、定量結果を解析してください。代替法として、Percent Input法により下記の公式を用いて、免疫沈降の効率を算出することもできます。この方法では、各免疫沈降で回収されたシグナルを、インプットクロマチン総量の割合 (%) で示します。

   Percent Input = 2% x 2^{(C[T] 2%Input Sample - C[T] IP Sample)}

   C[T] = C_T= PCR反応の閾値となるサイクル

IX. NG-seqライブラリーの調製

本キットを用いて調製したDNAサンプルは、直接ChIP-seqに使用できます。NG-シークエンスDNAライブラリーの構築は、採用予定のシーケンスプラットフォームと互換性のあるDNAライブラリー調製プロトコールまたはキットを使用して行ってください。Illumina^®​プラットフォームでのシーケンシングの場合、DNA Library Prep Kit for Illumina^® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795と、関連するインデックスプライマーMultiplex Oligos for Illumina^® (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580もしくは、Multiplex Oligos for Illumina^® (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538の使用を推奨します。

推奨事項：

• 転写因子またはコファクターのChIP-seqでは、ChIPで濃縮したDNAを少なくとも5 ng使用し、10サイクルのPCRでアダプター配列が結合したDNAを増幅してください。
• Totalヒストン、ヒストン修飾、そしてインプットサンプルについては、ChIPで濃縮したDNA 50 ngを使用するところから始め、6サイクルのPCRでアダプター配列が結合したDNAを増幅してください。
• どんなターゲットの種類に対しても、ChIPで濃縮したDNAのライブラリー構築でサイズセレクションを行わずに、アダプター配列が結合したDNAをクリーンナップしてください。
• DNAライブラリー構築後、Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Cat# G2938-90322)、または2%アガロースTAEゲルを用いて50-100 ngのDNAを電気泳動し、アダプターダイマー (約140 bp) がDNAライブラリーに存在するかどうかを確認してください。アダプターダイマーがDNAライブラリーに存在する場合は、PCR増幅産物のクリーンアップを繰り返してください。
• ライブラリーの品質は、既知のポジティブおよびネガティブコントロール用プライマーセットを用いたリアルタイムPCRにより確認することもできます。オリジナルのChIP産物を用いた結果と同様に、DNAライブラリーでもポジティブコントロールはネガティブコントロールと比較して高いシグナルが得られるはずです。
• 最終的なクリーンアップおよび品質チェックの後、最終精製ライブラリーサンプルを2 - 10 nMに調製してハイスループットシーケンシングに使用してください。

APPENDIX A：予想されるクロマチン収量

組織サンプルからクロスリンククロマチンを調製する場合、組織の種類によってクロマチン収量が大きく異なります。右の表には、4 x 10⁶個のHeLa細胞の場合と比較しながら、25 mgの組織から調製した場合に予想されるクロマチン収量と、予想されるDNA濃度を示しています。これらは、プロトコールのセクションIVに記載した方法で決定しています。各組織において、Medimachine (BD Biosciences) またはDounce Homogenizerのどちらを用いてホモジナイズした場合もクロマチン収量はほぼ同じでした。ただし、多くの場合、Medimachineを用いて破砕した組織から得たクロマチンは、Dounce Homogenizerを用いた場合よりも免疫沈降効率が高くなりました。脳組織サンプルに関しては、Medimachineでは単細胞懸濁液になるまで十分に破砕することができないため、Dounce Homogenizerを使用してください。最適なChIPの結果を得るためには、免疫沈降1回あたり5-10 µgの断片化したクロスリンククロマチンの使用をお勧めします。組織によっては、免疫沈降1回に必要な組織量が25 mgを超えることがあります。

組織/細胞	総クロマチン収量	予想されるDNA濃度
脾臓	25 mgの組織に対し20-30 µg	200 - 300 µg/mL
肝臓	25 mgの組織に対し10-15 µg	100 - 150 µg/mL
腎臓	25 mgの組織に対し8-10 µg	80 - 100 µg/mL
脳	25 mgの組織に対し2-5 µg	20 - 50 µg/mL
心臓	25 mgの組織に対し2-5 µg	20 - 50 µg/mL
HeLa	4 x 106個の細胞に対し10-15 µg	100 - 150 µg/mL

APPENDIX B：クロマチン断片化の最適化

クロスリンクしたクロマチンDNAを150-900 bpの長さに断片化する場合の最適条件は、断片化に用いる組織量または細胞数に対するMicrococcal Nucleaseの比率に大きく依存します。特定の組織または細胞タイプで、クロマチンの断片化の至適条件を決定するプロトコールを以下に示します。

1. プロトコールのセクションI、II、IIIに記載の通り、125 mgの組織または2 × 10⁷個の細胞 (5回分の免疫沈降に相当) を用いて、クロスリンクした細胞核を調製してください。セクションIIIのステップ2を行った後、下記に進んでください。
2. 細胞核サンプルを100 μLずつ1.5 mLの遠心分離用チューブ5本に分注し、氷上に置いてください。
3. Micrococcal Nuclease 3 μLを1X Buffer B + DTT混合液27 μLに加えてください (酵素を10倍に希釈します)。
4. 希釈したMicrococcal Nuclease 0 μL、2.5 μL、5 μL、7.5 μL、10 μLを、ステップ2で用意した5本の各チューブに加え、チューブを数回転倒混和し、頻繁に撹拌しながら37℃で20分間インキュベートしてください。
5. 10 M EDTA 0.5 μLを加えることで断片化を停止し、チューブを氷上に置いてください。
6. 16,000​ x gで1分間、4℃で遠心分離して細胞核を沈殿させ、上清を除去してください。
7. 細胞核を1X ChIP Buffer + PIC混合液200 μLに再懸濁してください。氷上で10分間インキュベートしてください。
8. ライセートを数回ソニケーション処理し、核膜を破砕してください。ソニケーション処理の合間に、サンプルを30秒間氷水に浸してインキュベートしてください。細胞核を完全に溶解するために必要な最適条件は、ソニケーション処理の前後に細胞核を光学顕微鏡で観察することで決定できます。VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator (1/8-inch probe) を6に設定し、20秒間のソニケーション処理を3回行うことで、HeLa細胞核は完全に溶解されます。代わりに、Dounce Homogenizerで20回ホモジェナイズしても細胞核を破砕できますが、破砕が不完全になる可能性があります。
9. 9,400​ x gで10分間、4°Cで遠心分離して、ライセートを清澄化してください。
10. ソニケーション処理した各ライセート50 μLを新しい遠心分離用チューブに移してください。
11. 各サンプル50 μLに、ヌクレアーゼフリー水100 μL、5M NaCl 6 μL、RNase A 2 μLを加え、ボルテックスにより混和し、37℃で30分間インキュベートしてください。
12. RNase Aで処理した各サンプルに、Proteinase K 2 μLを加え、ボルテックスにより混和し、65℃で2時間インキュベートしてください。
13. 各サンプル20 μLを、100 bp DNAマーカーとともに1%アガロースゲルで電気泳動し、DNA断片のサイズを確認してください。
14. 得られたDNAが150-900 bp (1-5個のヌクレオソームに相当) の範囲になる断片化条件を確認してください。この最適化プロトコールを用いて検討した目的サイズのDNA断片を生じる希釈したMicrococcal Nucleaseの量は、目的サイズのDNA断片を生じる1回分の免疫沈降サンプル (破砕した組織25 mgまたは4​ x 10⁶個の培養細胞) に加えられるMicrococcal Nuclease原液の10倍量に相当します。例えば、本プロトコールで希釈したMicrococcal Nuclease 5 μLにより150-900 bpのDNA断片が生じた場合、セクションIIでクロマチンを断片化する際には1回のIP prepにつき0.5 μLのMicrococcal Nuclease原液を加えることになります。
15. 目的サイズのDNAが得られなかった場合は、サンプル毎にMicrococcal Nuclease量を調整しながら、本最適化プロトコールを繰り返してください。もしくは、断片化時間を調整することでDNA断片化のサイズを最適化することができます。

APPENDIX C：トラブルシューティングガイド

問題	考えられる原因	推奨される対処法
1. 断片化されたクロマチンの濃度が低すぎる。	細胞数が不十分、あるいは断片化後の細胞核の破砕が不完全。	クロマチンサンプルのDNA濃度が50 μg/mLに近い場合は、1回の免疫沈降あたり少なくとも5 μgとなるようにクロマチン調製液を追加して、プロトコールに従って実験を続けてください。 クロスリンクの前に、カウント用に別に用意したディッシュで細胞数を計測し、正確な細胞数を確認してください。さらに、顕微鏡下でソニケーション前後の細胞核を観察し、核の完全な破砕を確認してください。
2. クロマチンの断片化が不十分で、断片が大きすぎる (900 bpを超える)。	細胞のクロスリンクが過剰。10分間以上クロスリンクを行うと、クロマチンの断片化を阻害する可能性がある。 細胞数が多すぎる、またはMicrococcal Nuclease量が足りない。	ホルムアルデヒド濃度を一定にして、時間経過に伴う変化を確認してください。クロスリンク時間を10分以下に短縮してください。 クロスリンクの前に別に用意したプレートの細胞数を計測し、Appendix Bを参照してクロマチンの断片化条件を最適化します。
3. クロマチンが過剰に断片化され、DNA断片のサイズが小さすぎる (150 bpのモノヌクレオソーム1個分の断片ばかりが検出される)。ヌクレオソーム1個分のDNAの長さになるまでクロマチンを完全に断片化すると、特に長さが150 bp以上のアンプリコンの場合、PCRでシグナルが減弱する可能性がある。	クロマチン断片化に加えた細胞数が不十分、またはMicrococcal Nuclease量が多すぎる。	クロスリンクの前に別に用意したプレートの細胞数を計測し、Appendix Bを参照してクロマチンの断片化条件を最適化します。
4. インプットDNAのPCR反応で産物が得られない、または得られる量が非常に少ない。	PCR反応に使用したDNA量が十分でない、またはPCR条件が最適でない。 PCRの増幅領域が、ヌクレオソームフリー領域に及んでいる。 IPに加えたクロマチンが十分でない、またはクロマチンの断片化が過剰。	PCR反応により多くのDNAを使用するか、サイクル数を増加させてください。 クロスリンク後に断片化したクロマチンから精製したDNAを用いて、プライマーセットに対する最適なPCR条件を検討してください。アンプリコンの長さが150 bp以下になるように、別のプライマーセットを設計してください (セクションIIIのプライマー設計に関する推奨事項を参照してください)。 最適なChIP結果を得るために、免疫沈降1回あたりクロマチン5-10 μgを加えてください。上記1、3の対応策も参照してください。
5. ポジティブコントロールであるHistone H3抗体の免疫沈降サンプルとRPL30プライマーを用いたPCR反応で増幅が起こらない。	免疫沈降に加えたクロマチンまたは抗体が十分でない、または免疫沈降のインキュベーション時間が短すぎる。 Protein G Beadsからのクロマチンの溶出が不十分である。	各免疫沈降反応にクロマチン5-10 μgと抗体10 μLを加えたことを確認して一晩インキュベートし、Protein G Beadsを加えてさらに2時間インキュベートしてください Protein G Beadsからのクロマチンの溶出には65℃が最適です。頻繁に撹拌してBeadsの懸濁状態を保ってください。
6. ネガティブコントロールのRabbit IgGの免疫沈降産物と、ポジティブコントロールのHistone H3抗体の免疫沈降産物で、PCRでの増幅が同程度になる。	免疫沈降に使用したクロマチン量が過剰、または十分でない。あるいは、免疫沈降に抗体を加えすぎている。 PCR反応に加えたDNAが多すぎる、またはサイクル数が多すぎる。	各免疫沈降反応に対して加える量は、クロマチン15 μg、Histone H3 antibody 10 μLを上限としてください。Normal rabbit IgG量を一回のIPあたり1 μLまで減らしてください。 PCR反応に加えるDNAを減らすか、PCRのサイクル数を減らしてください。PCRの線形増幅領域内でPCR産物を解析することが非常に重要です。そうしなければ、増幅前のDNA量の差が正確に測定できません。
7. 解析したいターゲットの抗体の免疫沈降産物で、PCR反応による増幅が起こらない。	PCR反応に加えたDNA量が十分でない。 免疫沈降に使用した抗体量が十分でない。 免疫沈降ではワークしない抗体である。	PCR反応により多くのDNAを使用するか、サイクル数を増加させてください。 通常は抗体1-5 μgを免疫沈降に加えます。しかし、実際に必要な量は抗体によって大きく異なります。 免疫沈降反応液に加える抗体の量を増やしてください。別の抗体を検討してください。

クロマチン免疫沈降

SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005の専用プロトコールです。

必要な試薬

キットに含まれている試薬：

1. Glycine Solution (10X) #7005
2. Buffer A (4X) #7006
3. Buffer B (4X) #7007
4. ChIP Buffer (10X) #7008
5. ChIP Elution Buffer (2X) #7009
6. 5 M NaCl #7010
7. 0.5 M EDTA #7011
8. ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006
9. DNA Binding Buffer #10007
10. DNA Wash Buffer #10008 (4倍量のエタノールを使用前に加えてください)
11. DNA Elution Buffer #10009
12. DNA Purification Columns #10010
13. Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012
14. RNAse A (10 mg/ml) #7013
15. Micrococcal Nuclease (2000 gel units/µL) #10011
16. Proteinase K (20 mg/ml) #10012
17. SimpleChIP^® Human RPL30 Exon 3 Primers 1 #7014
18. SimpleChIP^® Mouse RPL30 Intron 2 Primers 1 #7015
19. Histone H3 (D2B12) XP^® Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620
20. Normal Rabbit IgG #2729
21. DTT (Dithiothreitol) #7016

キットに含まれない試薬：

1. Magnetic Separation Rack #7017 / 14654
2. Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2 (Sterile) #9872
3. Nuclease-free Water #12931
4. エタノール (96 - 100%)
5. ホルムアルデヒド (37%ストック溶液)
6. Taq DNA Polymerase
7. dNTPミックス

I. 組織のクロスリンクおよびサンプル調製

組織を採取する際、脂肪や壊死組織などの不要な部分を取り除きます。組織を処理し直ちにクロスリンクするか、使用するまでドライアイスで凍結して保存してください。最適なクロマチン収量とChIP結果を得るため、各免疫沈降あたり25 mgの組織を使用します。クロマチン収量は組織の種類により異なるため、一部の組織では各免疫沈降あたり25 mgを超える量が必要となります。組織ごとに予測されるクロマチン収量については、Appendix Aを参照してください。クロマチンの断片化および濃度の解析 (セクションIV) のためにクロマチンサンプルを1本余分に用意してください。

実験開始前の準備：

• 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) と10X Glycine Solutionを取り出し、室温に戻してください。PICが完全に溶けていることを必ず確認してください。
• 25 mgの組織に対して、Phosphate Buffered Saline (PBS) 3​​ mL + 200X PIC 15​​ μLの混合液を調製して、氷上に置いてください。
• 25 mgの組織に対して、37%ホルムアルデヒド45 μLを用意し、室温に置いてください。使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。

A. クロスリンク

1. 新鮮組織または凍結組織サンプルを計量してください。免疫沈降1回あたり、25 mgの組織を使用します。
2. 組織サンプルを60 mmまたは100 mmのディッシュに置き、清潔な解剖用メスまたは剃刀の刃で細かく切り刻んでください。シャーレは氷上に置いてください。タンパク質分解を防ぐため、組織をよく冷やす必要があります。
3. ミンスした組織を、15 mLのコニカルチューブに移してください。
4. 25 mgの組織に対し、PBS + PIC混合液1 mLを加えてください。
5. タンパク質をDNAにクロスリンクするため、PBS + PIC混合液1 mLに対し、37%のホルムアルデヒド 45 μLを加え、室温で20分間振盪させてください。ホルムアルデヒドの終濃度は1.5%です。
6. PBS + PIC混合液1 mLに対して10X Glycine 100 μLを加えてクロスリンクを止め、5分間室温で混和してください。
7. 組織を、ベンチトップ遠心分離機を用いて4°C、1,500 rpmで5分間遠心してください。
8. 上清を取り除き、25 mgの組織に対しPBS + PIC混合液1 mLで一度洗ってください。
9. もう一度、ベンチトップ遠心分離機を用いて4°C、1,500 rpmで5分間遠心してください。
10. 上清を取り除き、25 mgの組織に対しPBS + PIC混合液1 mLで再懸濁し、氷上に置いてください。Medimachine (B) あるいはDounce Homogenizer (C) を用いて組織をバラバラにし、単細胞懸濁液を調製してください。

B. Medimachine (BD Biosciences：part #340587) を用いた組織破砕

1. 1000 μLピペットチップの先を切って穴を広げ、組織の塊が通るようにしてください。
2. PBS + PIC混合液1 mLに再懸濁した組織サンプルを、50 mm Medicone (part #340592) の上部チャンバーに移してください。
3. メーカーの推奨手順に従い、組織を2分間すり潰してください。
4. 1 mLのシリンジと先の鈍い18ゲージの注射針を用いて、Mediconeの一番下のチャンバーから細胞懸濁液を集めてください。細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移し、氷上に置いてください。
5. 組織全体がすり潰されて均質な懸濁液になるまで、ステップ2-4を繰り返してください。
6. さらにすり潰す必要がある場合、組織サンプルにPBS + PIC混合液を追加してください。組織全体がすり潰されて均質な懸濁液になるまで、ステップ2-5を繰り返してください。
7. 顕微鏡で単細胞懸濁液であることを確認してください (オプション)。
8. 細胞は、ベンチトップ遠心分離機を用いて4℃、1,500rpmで5分間遠心分離します。
9. 上清を取り除き、直ちに細胞核の調製とクロマチンの断片化に進んでください (セクション1)。

C. Dounce Homogenizerを用いた組織破砕

1. PBS + PIC混合液に再懸濁した組織をDounce Homogenizerに移してください。
2. 20-25回ストロークで組織を破砕します。顕微鏡で単細胞懸濁液であることを確認してください (オプション)。
3. 細胞を15 mLのコニカルチューブに移し、ベンチトップ遠心分離機を用いて4℃、1,500rpmで5分間遠心分離します。
4. 上清を取り除き、直ちに細胞核の調製とクロマチンの断片化に進んでください (セクション1)。

II. 培養細胞のクロスリンクおよびサンプル調製

最適なChIP結果を得るためには、各免疫沈降につき4​x10⁶細胞を使用してください。HeLa細胞では、増殖培地20 mLで90%コンフルエントに培養した15 cmディッシュの半分量に相当します。クロマチンサンプルを1本余分に用意し、クロマチンの断片化および濃度についての解析に使用します (セクションIV)。血球計算盤を使用した細胞数測定に使用するために、培養ディッシュを余分に1枚用意してください。

実験開始前の準備

• 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012と10X Glycine Solution #7005を取り出し、室温に戻してください。PICが完全に溶けていることを必ず確認してください。
• 15 cmディッシュ1枚あたり、Phosphate Buffered Saline (PBS) 2 mL + 200X PIC 10 μLを調製して、氷上に保持してください。
• 15 cmディッシュ1枚あたりPBS 40 mLを調製し、氷上に保持してください。
• 15 cmディッシュ1枚分の細胞に対して、37%ホルムアルデヒド540 μLを調製し、室温に保持してください。使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。

1. タンパク質をDNAにクロスリンクするために、20 mLの培地を入れた15 cm培養ディッシュに対して、37%ホルムアルデヒド540 μLを加えてください。手早くディッシュを傾けて混ぜ合わせ、室温で10分間インキュベートしてください。最終的なホルムアルデヒド濃度は1%です。ホルムアルデヒドを加えると、培地の色が変化することがあります。
2. 10X Glycine Solution 2 mLを、培地が20 mL入ったそれぞれの15 cmディッシュに加え、手早く回して混ぜ合わせ、室温で5分間インキュベートしてください。glycineを加えると、培地の色が変化することがあります。
3. 浮遊細胞では、細胞を50mLのコニカルチューブに移し、4°Cのベンチトップ遠心分離機を用いて1,500 rpmで5分間遠心分離し、ペレットを氷冷したPBS 20 mLで2度洗ってください。上清を取り除き、直ちに核の調製とクロマチンの断片化 (セクションII) に進んでください。
4. 接着細胞の場合は、培地を取り除き、細胞を氷冷した1X PBS 20 mLで2回洗ってください。毎回、洗いの液を完全に取り除いてください。
5. 氷冷したPBS + PIC混合液2 mLを、それぞれの15 cmのディッシュに加えてください。細胞を掻き取り、バッファーに懸濁してください。すべてのディッシュから集めた細胞をコニカルチューブ (15 mL) 1本に集めてください。
6. 細胞は、ベンチトップ遠心分離機を用いて4℃にて1,500rpm5分間、遠心分離します。上清を取り除き、直ちに核の調製とクロマチンの断片化 (セクションII) に進んでください。

III. 核の調製とクロマチンの断片化

免疫沈降サンプル 1回分は、25 mgの破砕した組織または4​ x 10⁶の培養細胞に相当します。

実験開始前の準備

• 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012を取り出し、室温に戻してください。使用前に完全に解凍されていることを確認してください。

• 1 M DTT (DTT #7016 192.8 mg + 精製水 (dH₂O) 1.12 mL) を調製します。DTTの結晶が完全に溶解されていることを確認してください。

  重要：溶解したら、1M DTTは-20℃で保存してください。

• 10X ChIP Buffer #7008を取り出して室温に戻し、SDSが完全に溶解していることを確かめてください。
• IP prepにつき、1X Buffer A 1 mL (4X Buffer A #7006 250 μL + 水750 μL) + 1M DTT 0.5 μL + 200X PIC 5 μL混合液を調製し、氷上に保持してください。
• IP prepにつき、1X Buffer B ​1.1 mL (4X Buffer B #7007​​ 275 μL + 水825 μL) + 1M DTT 0.55 μL混合液を調製し、氷上に置いてください。
• IP prepにつき、1X ChIP Buffer ​100 μL (10X ChIP Buffer #7008 10 μL + 水90 μL) + 200X PIC 0.5 μL混合液を調製し、氷上に保持してください。。

1. 細胞を、氷冷した1X Buffer A + DTT + PIC混合液1 mL (IP prepにつき) に再懸濁してください。氷上で10分間インキュベートしてください。3分ごとに、チューブを転倒混和してください。
2. ベンチトップ遠心分離機を用いて、4℃、3,000 rpmで5分間遠心分離し、核をペレット化します。上清を取り除き、氷冷した1X Buffer B + DTT混合液1 mL (IP prepにつき) でペレットを再懸濁してください。再度遠心分離して上清を取り除き、ペレットを1X Buffer B + DTT混合液100 µL (IP prepにつき) に再懸濁してください。1.5​ mLの微量遠心分離用チューブに移してください (チューブ1本あたり最大1 mLまで)。
3. IP prepにつき、Micrococcal Nuclease #10011​ 0.5 μLを加え、数回転倒混和してください。37℃で20分間頻繁に混和しながらインキュベートし、約150-900 bpの長さにDNAを断片化してください。3-5分ごとに転倒混和してください。DNAを最適なサイズに断片化するために必要なMicrococcal Nucleaseの量は、各組織および細胞株の検討結果に基づいて決定しなければならない場合があります (Appendix B参照)。HeLaの細胞核の場合、​4 x 10⁶個の細胞につきMicrococcal Nuclease 0.5 μL、マウス肝臓の場合、25 mgの組織につきMicrococcal Nuclease 0.5 μLを処理すると、適切なサイズのDNA断片に断片化できます。
4. IP prepにつき、 0.5M EDTA # 7011 10 μLを加えることで断片化を停止し、チューブを氷上に置いてください。
5. 13,000 rpm、4℃で1分間微量遠心分離して細胞核を沈殿させ、上清を除去してください。
6. 核ペレットを、IP prepにつき1X ChIP Buffer + PIC混合液100 μLで再懸濁し、氷上で10分間インキュベートしてください。
7. 1.5 mLの遠心分離用チューブに、1本あたり最大500 μLまでのライセートを入れ、2、3回ソニケーション処理を行うことで核膜を壊してください。ソニケーション処理の合間に、サンプルを30秒間氷水に浸してください。細胞核を完全に溶解するために必要な最適条件は、ソニケーション処理の前後に細胞核を光学顕微鏡で観察することで決定できます。VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator (1/8-inch probe) の場合、6に設定し、20秒間のソニケーション処理を3​セット行うことで、HeLa細胞の核は完全に破砕されます。代わりに、Dounce Homogenizerで20回ホモジェナイズしても細胞核を破砕できますが、破砕が不完全になる可能性があります。
8. ライセートを​10,000 rpmで10分間、4℃で遠心分離してください。
9. 上清を新しいチューブに移してください。これが、クロスリンクしたクロマチン調製液です。使用するまで‐80℃で保存します。50 μLのクロマチン調製液を、クロマチンの断片化および濃度の解析 (セクションIV) に使用します。

IV. クロマチンの断片化および濃度の解析 (推奨ステップ)

1. クロマチンサンプル 50 μL (セクションIIIのステップ9) に、Nuclease-free water 100 μL、5 M NaCl #7010 6 μL、およびRNAse A #7013 2 μLを加えてください。ボルテックスで混和し、37℃で30分間インキュベートしてください。
2. RNase Aで処理した各サンプルに、Proteinase K 2 μLを加え、ボルテックスにより混和し、65℃で2時間インキュベートしてください。
3. セクションVIIに記載されているとおり、DNA精製用スピンカラムを用いてDNAをサンプルから精製してください。
4. DNA精製後、各サンプル10 μLを、100 bpのDNAマーカーとともに1%アガロースゲルで電気泳動し、DNA断片のサイズを測定してください。DNAが約150-900 bp (1-5​個のヌクレオソーム、図1参照) のサイズに断片化されているはずです。
5. DNA濃度を測定するため、精製したDNA 2 μLをNuclease-free water 98 μLに入れて50倍希釈し、OD₂₆₀を記録してください。原液のDNA濃度 (μg/mL) は、OD₂₆₀ x 2,500となります。理想的なDNA濃度は50-200 μg/mLです。

注意：最適なChIPの結果を得るためには、クロマチンのサイズと濃度を適切にすることが非常に重要です。クロマチンを断片化しすぎると、定量PCRのシグナルが消失する可能性があります。一方で、クロマチンの断片化が不十分な場合、バックグラウンドシグナルが上昇し分解能が低下します。また、免疫沈降に用いるクロマチン量が少なすぎると、定量PCRのシグナルが低下する原因になります。クロマチンの断片化を最適化するためのプロトコルは、Appendix Bに記載されています。

V. クロマチン免疫沈降 (ChIP)

最適なChIPの結果を得るため、免疫沈降1回あたり約5-10 μgの断片化されたクロスリンククロマチン (セクションIVに記載) を使用してください。これは、25 mgの破砕した組織あるいは4​ x 10⁶​個の培養細胞から調製された免疫沈降サンプル100 μL分に概ね相当します。一般的には、抗体を加える前にクロマチンサンプル100 μLを1X ChIP Buffer 400 μLで希釈しますが、免疫沈降1回あたり100 μL以上必要な場合は下記のようにクロマチンサンプルを希釈する必要はありません。希釈しない場合も、クロマチンサンプルに直接抗体を加えることでクロマチン複合体の免疫沈降ができます。

実験開始前の準備

• 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012を取り出し、室温に戻してください。PICが完全に溶けていることを必ず確認してください。
• 10X ChIP Buffer #7008を取り出して室温に戻し、SDSが完全に溶解していることを確かめてください。
• 断片化したクロマチン調製液 (セクションIIIのステップ9から) を解凍し、氷上で解凍します。
• Low salt washの調製：免疫沈降1回につき、1X ChIP Buffer (10X ChIP Buffer #7008 300 µL + 水2.7 mL) 3 mL。使用するまで室温で保持してください。
• High salt washの調製：免疫沈降1回につき、1X ChIP Buffer (10X ChIP Buffer #7008 100 µL + 水900 µL) 1 mL + 5 M NaCl #7010 70 µL。使用するまで室温で保持してください。

1. 1本のチューブに、予定の免疫沈降回数分の消化クロマチンを調製する希釈操作に十分な量の1X ChIP Bufferを用意します：免疫沈降1回につき、1X ChIP Buffer (10X ChIP Buffer 40 µL + 水360 µL) 400 µL + 200X PIC <ut>2</ut> µL。免疫沈降のサンプル数を決定する時には、ポジティブコントロールのHistone H3 (D2B12) XP^® Rabbit mAb #4620およびネガティブコントロールのNormal Rabbit IgG Antibody #2729​​のサンプルを数に含めてください。調製したチューブを氷上に保持してください。
2. 調製した1X ChIP Bufferへ、断片化とクロスリンクをしたクロマチン調製液 (セクションIIIのステップ9) を免疫沈降1回あたり100 μL (5-10 μgのクロマチンに相当する量) 加えます。例えば、10​回分の免疫沈降では、1X ChIP Buffer 4 mL (10X ChIP Buffer 400 μL + 水3.6 mL) + 200X PIC 20 μL + 断片化したクロマチン調製液1 mLを入れたチューブを1本調製してください。
3. 希釈したクロマチン10 μLを遠心分離用チューブに移してください。これが2%インプットサンプルです。使用するまで-20℃で保存してください (セクションVIのステップ1で使用します)。
4. 免疫沈降ごとに、断片化したクロマチン500 μLを1.5 mLの遠心分離用チューブに分注し、免疫沈降用抗体を加えてください。必要な抗体量は免疫沈降ごとに異なりますので、お客様ご自身で決定する必要があります。ポジティブコントロールのHistone H3 (D2B12) XP^®​Rabbit mAb #4620については、10 μLを免疫沈降サンプルに加えてください。ネガティブコントロールのNormal Rabbit IgG #2729については、1-2 μL (1-2 μg) を免疫沈降サンプルに加えます*。ローテーターを用いて、免疫沈降サンプルを4℃で4時間から一晩インキュベートしてください。

注意：Cell Signaling Technologyのほとんどの抗体は、免疫沈降1回あたり1-2 µgを使用することで適切にワークします。濃度の異なる複数の抗体がある場合は、最も高い抗体濃度にネガティブコントロールNormal Rabbit IgG #2729の濃度を合わせて使用することをお勧めします。

5. ChIP Grade Protein G Magnetic Beads #9006を穏やかにボルテックスし、再懸濁してください。直ちにProtein G Magnetic Beads 30 μLをそれぞれの免疫沈降反応液に加え、ローテーターを用いて、4℃で2時間インキュベートしてください。
6. 各免疫沈降ごとにチューブをMagnetic Separation Rack #7017にセットし、Protein G Magnetic Beadsを分離させてください。溶液が澄むまで1-2分間待ち、上清を注意深く取り除いてください。
7. low salt wash 1 mLをBeadsに加えてProtein G Magnetic Beadsを洗い、4℃で5分間ローテーターを用いてインキュベートします。ステップ6と7を更に2回繰り返し、計3回low salt washで洗ってください。
8. high salt wash 1 mLをBeadsに加え、4℃で5分間ローテーターを用いてインキュベートしてください。
9. 各免疫沈降ごとにチューブをMagnetic Separation Rackにセットし、Protein G Magnetic Beadsを分離させてください。溶液が澄むまで1-2分間待ち、上清を注意深く取り除いてください。直ちにセクションVIに進んでください。

VI. 抗体/Protein G Magnetic Beadsからのクロマチンの溶出および脱クロスリンク

実験開始前の準備

• 37℃のウォーターバスで2X ChIP Elution Buffer #7009を温め、SDSが完全に溶解していることを確認してください。
• 水浴またはサーモミキサーを65℃に設定してください。
• 各免疫沈降サンプルおよび2%インプットサンプルごとに、1X ChIP Elution Buffer 150 μL (2X ChIP Elution Buffer #7009 75 μL+ 水75 μL) を用意してください。

1. 1X ChIP Elution Buffer 150 μLを、2%インプットサンプル入りのチューブに加え、ステップ6で使用するまで室温に置いておきます。
2. 1X ChIP Elution Buffer 150 μLを、それぞれの免疫沈降サンプルに加えてください。
3. 静かにボルテックス (1,200 rpm) しながら、65℃で30分間処理し、抗体/Protein G Magnetic Beads複合体からクロマチンを溶出してください。本ステップには、サーモミキサーの使用をお勧めします。代わりにローテーターを用いて室温で溶出することもできますが、完全に溶出されない可能性があります。
4. チューブをMagnetic Separation Rackにセットし、液が澄むまで1-2分間待ち、Protein G Magnetic Beadsを分離させてください。
5. 溶出されたクロマチンを含む上清を、注意深く新しいチューブに移してください。
6. ステップ1で調製した2%インプットサンプルを含むすべてのチューブに、5M NaCl 6 μLおよびProteinase K #10012​ 2 μLを加えて65℃で2時間インキュベートし、脱クロスリンクしてください。インキュベーションは一晩まで延長することができます。
7. 直ちにセクションVIIに進んでください。もしくは、サンプルを‐20℃で保存してください。ただし、沈殿物の形成を防ぐために、DNA Binding Buffer #10007を加える前に (セクションVIIのステップ1)、必ずサンプルを室温に戻してください。

VII. スピンカラムを用いたDNAの精製

実験開始前の準備

• 使用前に、エタノール (96 - 100%) 24 mLをDNA Wash Buffer #10008​​に加えてください。このステップは、DNA精製の最初のセッティングの前に1度だけ実施してください。
• セクションVで得られた各DNAサンプルに対し、DNA Purification collection tube #10010​​を一つずつ用意してください。

1. DNA Binding Buffer #10007​ 750 μLを各DNAサンプルに加え、軽くボルテックスしてください。
   • 1サンプルあたり5倍量のDNA Binding Bufferを使用します。
2. ステップ1のサンプル450 μLを、コレクションチューブにセットしたDNAスピンカラムに移してください。
3. 14,000 rpmで30秒間遠心分離してください。
4. コレクションチューブからスピンカラムを取り外し、液体を廃棄してください。スピンカラムをコレクションチューブに再セットしてください。
5. ステップ1で残った各サンプル450 μLを、コレクションチューブにセットしたスピンカラムに移してください。ステップ3と4を繰り返してください。
6. DNA Wash Buffer #10008 750 μLを、コレクションチューブにセットしたスピンカラムに加えてください。
7. 14,000 rpmで30秒間遠心分離してください。
8. コレクションチューブからスピンカラムを取り外し、液体を廃棄してください。スピンカラムをコレクションチューブに再セットしてください。
9. 14,000 rpmで30秒間遠心分離してください。
10. コレクションチューブと液体を廃棄してください。スピンカラムは廃棄しないでください。
11. DNA Elution Buffer #10009 50 μLを各スピンカラムに加え、新しい1.5 mLの遠心分離用チューブにセットしてください。
12. 14,000 rpmで30秒間遠心分離し、DNAを溶出してください。
13. DNAスピンカラムを取り外し、廃棄してください。得られた溶出液が精製されたDNAです。サンプルは-20℃で保存することができます。

VIII. PCRによるDNAの定量

推奨される対処法

• コンタミネーションを防ぐため、ピペットチップはフィルター付きのものを使用してください。
• キットに含まれているコントロールプライマーは、ヒトとマウスのRPL30遺伝子 (#7014​と#7015) に特異的で、通常のPCRまたは定量的リアルタイムPCRのどちらにも使用することができます。他の動物種でChIPを実施する場合は、その種で使用可能な適切なプライマーを設計し、最適なPCR条件を決定してください。
• 非特異的なPCR産物の増幅を防ぐため、ホットスタート用Taqポリメラーゼの使用を推奨します。
• プライマーの設定は非常に重要です。以下の条件に近いプライマーを設計してください:

プライマーの長さ：	24塩基
Tm：	60°C
GC：	50%
アンプリコンのサイズ：	150-200 bp (通常のPCR)
	80-160 bp (定量的リアルタイムPCR)

通常のPCR：

1. 0.2 mLのPCRチューブに適切な番号をラベルしてください。2%インプットサンプル、ポジティブコントロールのHistone H3サンプル、ネガティブコントロールのNormal Rabbit IgGサンプル、およびDNAコンタミネーションに対するコントロールとしてDNAなしのチューブを用意してください。
2. 各チューブにDNAサンプル2 μLを分注してください。
3. 分量不足を防ぐために、実際のチューブの本数に2本追加した量を全体量として、マスターミックスを下記の通りに調製してください。各反応用チューブにマスターミックス18 μLを加えてください。

試薬	PCR反応1回分の分量 (18 μL)
Nuclease-free H2O	12.5 µL
10X PCR Buffer	2.0 µL
4 mM dNTP Mix	1.0 µL
5 µM RPL30 プライマー	2.0 µL
Taq DNA Polymerase	0.5 µL

4. PCR反応を以下のプログラムで開始してください：

a.	初期変性	95℃	5分間
b.	変性	95℃	30 秒間
c.	アニーリング	62℃	30 秒間
d.	伸長反応	72℃	30 秒間
e.	ステップb-dを繰り返し、計34サイクル反応させてください。
f.	最終伸長反応	72℃	5分間

5. 反応終了後、100 bpのDNAマーカーとともに、各PCR産物10 μLを2%アガロースゲルまたは10%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動してください。予想されるPCR産物のサイズは、Human RPL30 #7014では161 bp、Mouse RPL30 #7015では159 bpです。

定量的リアルタイムPCR：

1. 使用するPCR装置のモデルに対応するPCRチューブあるいはPCRプレートに、適切なサンプル番号を記載してください。PCR反応には、ポジティブコントロールのHistone H3サンプル、ネガティブコントロールのNormal Rabbit IgGサンプル、DNAコンタミネーション確認用のコントロールとしてDNAを含まないチューブ、および標準曲線の作成と増幅効率の決定のため2%インプットクロマチンDNAの段階希釈サンプル (希釈なし、1：5、1：25、1：125) を用意してください。
2. PCRチューブあるいはPCRプレートのウェルに、適切なDNAサンプル2 μLを加えてください。
3. 以下のように、マスターミックスを調製してください。分量不足を考慮して、実際のチューブの本数に2本追加した量を全体量として、調製してください。各PCRチューブあるいは各ウェルにマスターミックス18 μLを加えてください。

試薬	PCR反応1回分の分量 (18 μL)
Nuclease-free H2O	6 µL
5 µM RPL30 プライマー	2 µL
SYBR-Green Reaction Mix	10 µL

4. PCR反応を以下のプログラムで開始してください：

a.	初期変性	95℃ 3分間
b.	変性	95℃ 15秒間
c.	アニーリングおよび伸長：	60℃ 60秒間
d.	ステップb - cの繰り返し (合計40サイクル)

5. リアルタイムPCR装置に付属のソフトウェアを使用して、定量結果を解析してください。代替法として、Percent Input法により下記の公式を用いて、免疫沈降の効率を算出することもできます。この方法では、各免疫沈降で回収されたシグナルを、インプットクロマチン総量の割合 (%) で示します。

   Percent Input = 2% x 2^{(C[T] 2%Input Sample - C[T] IP Sample)}

   C[T] = C_T= PCR反応の閾値となるサイクル

IX. NG-seqライブラリーの調製

本キットを用いて調製したDNAサンプルは、直接ChIP-seqに使用できます。NG-シークエンスDNAライブラリーの構築は、採用予定のシーケンスプラットフォームと互換性のあるDNAライブラリー調製プロトコールまたはキットを使用して行ってください。Illumina^®​プラットフォームでのシーケンシングの場合、DNA Library Prep Kit for Illumina^® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795と、関連するインデックスプライマーMultiplex Oligos for Illumina^® (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580もしくは、Multiplex Oligos for Illumina^® (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538の使用を推奨します。

推奨事項：

• 転写因子またはコファクターのChIP-seqでは、ChIPで濃縮したDNAを少なくとも5 ng使用し、10サイクルのPCRでアダプター配列が結合したDNAを増幅してください。
• Totalヒストン、ヒストン修飾、そしてインプットサンプルについては、ChIPで濃縮したDNA 50 ngを使用するところから始め、6サイクルのPCRでアダプター配列が結合したDNAを増幅してください。
• どんなターゲットの種類に対しても、ChIPで濃縮したDNAのライブラリー構築でサイズセレクションを行わずに、アダプター配列が結合したDNAをクリーンナップしてください。
• DNAライブラリー構築後、Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Cat# G2938-90322)、または2%アガロースTAEゲルを用いて50-100 ngのDNAを電気泳動し、アダプターダイマー (約140 bp) がDNAライブラリーに存在するかどうかを確認してください。アダプターダイマーがDNAライブラリーに存在する場合は、PCR増幅産物のクリーンアップを繰り返してください。
• ライブラリーの品質は、既知のポジティブおよびネガティブコントロール用プライマーセットを用いたリアルタイムPCRにより確認することもできます。オリジナルのChIP産物を用いた結果と同様に、DNAライブラリーでもポジティブコントロールはネガティブコントロールと比較して高いシグナルが得られるはずです。
• 最終的なクリーンアップおよび品質チェックの後、最終精製ライブラリーサンプルを2 - 10 nMに調製してハイスループットシーケンシングに使用してください。

APPENDIX A：予想されるクロマチン収量

組織サンプルからクロスリンククロマチンを調製する場合、組織の種類によってクロマチン収量が大きく異なります。右の表には、4 x 10⁶個のHeLa細胞の場合と比較しながら、25 mgの組織から調製した場合に予想されるクロマチン収量と、予想されるDNA濃度を示しています。これらは、プロトコールのセクションIVに記載した方法で決定しています。各組織において、Medimachine (BD Biosciences) またはDounce Homogenizerのどちらを用いてホモジナイズした場合もクロマチン収量はほぼ同じでした。ただし、多くの場合、Medimachineを用いて破砕した組織から得たクロマチンは、Dounce Homogenizerを用いた場合よりも免疫沈降効率が高くなりました。脳組織サンプルに関しては、Medimachineでは単細胞懸濁液になるまで十分に破砕することができないため、Dounce Homogenizerを使用してください。最適なChIPの結果を得るためには、免疫沈降1回あたり5-10 µgの断片化したクロスリンククロマチンの使用をお勧めします。組織によっては、免疫沈降1回に必要な組織量が25 mgを超えることがあります。

組織/細胞	総クロマチン収量	予想されるDNA濃度
脾臓	25 mgの組織に対し20-30 µg	200 - 300 µg/mL
肝臓	25 mgの組織に対し10-15 µg	100 - 150 µg/mL
腎臓	25 mgの組織に対し8-10 µg	80 - 100 µg/mL
脳	25 mgの組織に対し2-5 µg	20 - 50 µg/mL
心臓	25 mgの組織に対し2-5 µg	20 - 50 µg/mL
HeLa	4 x 106個の細胞に対し10-15 µg	100 - 150 µg/mL

APPENDIX B：クロマチン断片化の最適化

クロスリンクしたクロマチンDNAを150-900 bpの長さに断片化する場合の最適条件は、断片化に用いる組織量または細胞数に対するMicrococcal Nucleaseの比率に大きく依存します。特定の組織または細胞タイプで、クロマチンの断片化の至適条件を決定するプロトコールを以下に示します。

1. プロトコールのセクションI、II、IIIに記載の通り、125 mgの組織または2 × 10⁷個の細胞 (5回分の免疫沈降に相当) を用いて、クロスリンクした細胞核を調製してください。セクションIIIのステップ2を行った後、下記に進んでください。
2. 細胞核サンプルを100 μLずつ1.5 mLの遠心分離用チューブ5本に分注し、氷上に置いてください。
3. Micrococcal Nuclease 3 μLを1X Buffer B + DTT混合液27 μLに加えてください (酵素を10倍に希釈します)。
4. 希釈したMicrococcal Nuclease 0 μL、2.5 μL、5 μL、7.5 μL、10 μLを、ステップ2で用意した5本の各チューブに加え、チューブを数回転倒混和し、頻繁に撹拌しながら37℃で20分間インキュベートしてください。
5. 10 M EDTA 0.5 μLを加えることで断片化を停止し、チューブを氷上に置いてください。
6. 13,000 rpm、4℃で1分間微量遠心分離して細胞核を沈殿させ、上清を除去してください。
7. 細胞核を1X ChIP Buffer + PIC混合液200 μLに再懸濁してください。氷上で10分間インキュベートしてください。
8. ライセートを数回ソニケーション処理し、核膜を破砕してください。ソニケーション処理の合間に、サンプルを30秒間氷水に浸してインキュベートしてください。細胞核を完全に溶解するために必要な最適条件は、ソニケーション処理の前後に細胞核を光学顕微鏡で観察することで決定できます。VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator (1/8-inch probe) を6に設定し、20秒間のソニケーション処理を3回行うことで、HeLa細胞核は完全に溶解されます。代わりに、Dounce Homogenizerで20回ホモジェナイズしても細胞核を破砕できますが、破砕が不完全になる可能性があります。
9. ライセートを​10,000 rpmで10分間、4℃で遠心分離してください。
10. ソニケーション処理した各ライセート50 μLを新しい遠心分離用チューブに移してください。
11. 各サンプル50 μLに、ヌクレアーゼフリー水100 μL、5M NaCl 6 μL、RNase A 2 μLを加え、ボルテックスにより混和し、37℃で30分間インキュベートしてください。
12. RNase Aで処理した各サンプルに、Proteinase K 2 μLを加え、ボルテックスにより混和し、65℃で2時間インキュベートしてください。
13. 各サンプル20 μLを、100 bp DNAマーカーとともに1%アガロースゲルで電気泳動し、DNA断片のサイズを確認してください。
14. 得られたDNAが150-900 bp (1-5個のヌクレオソームに相当) の範囲になる断片化条件を確認してください。この最適化プロトコールを用いて検討した目的サイズのDNA断片を生じる希釈したMicrococcal Nucleaseの量は、目的サイズのDNA断片を生じる1回分の免疫沈降サンプル (破砕した組織25 mgまたは4​ x 10⁶個の培養細胞) に加えられるMicrococcal Nuclease原液の10倍量に相当します。例えば、本プロトコールで希釈したMicrococcal Nuclease5 μLにより150-900 bpのDNA断片が生じた場合、セクションIIIでクロマチンを断片化する際には1回の免疫沈降につき0.5 μLのMicrococcal Nuclease原液を加えることになります。
15. 目的サイズのDNAが得られなかった場合は、サンプル毎にMicrococcal Nuclease量を調整しながら、本最適化プロトコールを繰り返してください。もしくは、断片化時間を調整することでDNA断片化のサイズを最適化することができます。

APPENDIX C：トラブルシューティングガイド

問題	考えられる原因	推奨される対処法
1. 断片化されたクロマチンの濃度が低すぎる。	細胞数が不十分、あるいは断片化後の細胞核の破砕が不完全。	クロマチンサンプルのDNA濃度が50 μg/mLに近い場合は、1回の免疫沈降あたり少なくとも5 μgとなるようにクロマチン調製液を追加して、プロトコールに従って実験を続けてください。 クロスリンクの前に、カウント用に別に用意したディッシュで細胞数を計測し、正確な細胞数を確認してください。さらに、顕微鏡下でソニケーション前後の細胞核を観察し、核の完全な破砕を確認してください。
2. クロマチンの断片化が不十分で、断片が大きすぎる (900 bpを超える)。	細胞のクロスリンクが過剰。10分間以上クロスリンクを行うと、クロマチンの断片化を阻害する可能性がある。 細胞数が多すぎる、またはMicrococcal Nuclease量が足りない。	ホルムアルデヒド濃度を一定にして、時間経過に伴う変化を確認してください。クロスリンク時間を10分以下に短縮してください。 クロスリンクの前に別に用意したプレートの細胞数を計測し、Appendix Bを参照してクロマチンの断片化条件を最適化します。
3. クロマチンが過剰に断片化され、DNA断片のサイズが小さすぎる (150 bpのモノヌクレオソーム1個分の断片ばかりが検出される)。ヌクレオソーム1個分のDNAの長さになるまでクロマチンを完全に断片化すると、特に長さが150 bp以上のアンプリコンの場合、PCRでシグナルが減弱する可能性がある。	クロマチン断片化に加えた細胞数が不十分、またはMicrococcal Nuclease量が多すぎる。	クロスリンクの前に別に用意したプレートの細胞数を計測し、Appendix Bを参照してクロマチンの断片化条件を最適化します。
4. インプットDNAのPCR反応で産物が得られない、または得られる量が非常に少ない。	PCR反応に使用したDNA量が十分でない、またはPCR条件が最適でない。 PCRの増幅領域が、ヌクレオソームフリー領域に及んでいる。 IPに加えたクロマチンが十分でない、またはクロマチンの断片化が過剰。	PCR反応により多くのDNAを使用するか、サイクル数を増加させてください。 クロスリンク後に断片化したクロマチンから精製したDNAを用いて、プライマーセットに対する最適なPCR条件を検討してください。アンプリコンの長さが150 bp以下になるように、別のプライマーセットを設計してください (セクションIIIのプライマー設計に関する推奨事項を参照してください)。 最適なChIP結果を得るために、免疫沈降1回あたりクロマチン5-10 μgを加えてください。上記1、3の対応策も参照してください。
5. ポジティブコントロールであるHistone H3抗体の免疫沈降サンプルとRPL30プライマーを用いたPCR反応で増幅が起こらない。	免疫沈降に加えたクロマチンまたは抗体が十分でない、または免疫沈降のインキュベーション時間が短すぎる。 Protein G Beadsからのクロマチンの溶出が不十分である。	各免疫沈降反応にクロマチン5-10 μgと抗体10 μLを加えたことを確認して一晩インキュベートし、Protein G Beadsを加えてさらに2時間インキュベートしてください Protein G Beadsからのクロマチンの溶出には65℃が最適です。頻繁に撹拌してBeadsの懸濁状態を保ってください。
6. ネガティブコントロールのRabbit IgGの免疫沈降産物と、ポジティブコントロールのHistone H3抗体の免疫沈降産物で、PCRでの増幅が同程度になる。	免疫沈降に使用したクロマチン量が過剰、または十分でない。あるいは、免疫沈降に抗体を加えすぎている。 PCR反応に加えたDNAが多すぎる、またはサイクル数が多すぎる。	各免疫沈降反応に対して加える量は、クロマチン15 μg、Histone H3 antibody 10 μLを上限としてください。Normal rabbit IgG量を一回のIPあたり1 μLまで減らしてください。 PCR反応に加えるDNAを減らすか、PCRのサイクル数を減らしてください。PCRの線形増幅領域内でPCR産物を解析することが非常に重要です。そうしなければ、増幅前のDNA量の差が正確に測定できません。
7. 解析したいターゲットの抗体の免疫沈降産物で、PCR反応による増幅が起こらない。	PCR反応に加えたDNA量が十分でない。 免疫沈降に使用した抗体量が十分でない。 免疫沈降ではワークしない抗体である。	PCR反応により多くのDNAを使用するか、サイクル数を増加させてください。 通常は抗体1-5 μgを免疫沈降に加えます。しかし、実際に必要な量は抗体によって大きく異なります。 免疫沈降反応液に加える抗体の量を増やしてください。別の抗体を検討してください。

CUT&RUNプロトコール

I.細胞と組織のサンプルの調製

ほとんどの細胞タイプにおいて、CUT&RUNアッセイに生細胞を用いることにより、ヒストンや転写因子、コファクターを安定して濃縮できます。Concanavalin Aに感受性がある、または敏感な細胞の場合は、軽く固定することにより細胞を無傷のまま保存できます。また、新鮮な細胞を用いても安定したシグナルがみられない場合は、存在量の少ない、あるいは結合力の弱い転写因子やコファクターの濃縮が、固定することによって促進される可能性があります。細胞の過剰な固定はCUT&RUNアッセイを阻害することにご注意ください。

弊社のCUT&RUNアッセイは、広範囲な細胞や組織サンプルを解析できます。プロトコールに記載されているように、1回あたり5,000-250,000個の細胞または1-5 mgの組織を用いてCUT&RUN反応を行うことができます。この範囲であれば、プロトコール全体を通して使用するバッファーの量を1反応あたりの細胞や組織の量に応じて調整する必要はありません。指示がある場合には、実施する反応の数に応じてバッファーの量を比例的に増やす必要があります。可能であれば、1反応あたり100,000個の細胞または1 mgの組織を使用することを推奨します。細胞数に限りがある場合、ヒストン修飾の解析には1反応あたり少なくとも5,000-10,000細胞、転写因子やコファクターの解析には1反応あたり10,000-20,000細胞を使用することを推奨します。

NOTE: The amount of digitonin recommended for cell permeabilization is in excess and should be sufficient for permeabilization of most cell lines and tissue types. ただし、すべての細胞株や組織が、ジギトニンに対して同じ感受性を示す訳ではありません。特定の細胞株や組織で推奨濃度のジギトニンが機能しない場合、Appendix Aのプロトコールに従って条件を最適化することができます。ジギトニン処理で90%以上の細胞が透過化される必要があります。

A. 生細胞サンプルの調製

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&RUN反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012と100X Spermidine #27287を取り出して温めてください。両者とも必ず完全に解凍してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。
• 1X Wash Buffer (1細胞株あたり2 mL、1反応あるいは1インプットサンプルあたり追加で100 µL) を調製してください。例えば、1X Wash Buffer 2.5 mLを調製する場合、10X Wash Buffer #31415 250 µL + 100X Spermidine #27287 25 µL + 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 12.5 µL + Nuclease-free Water #12931 2212.5 µLを加えてください。細胞へのストレスを最小限にするため、室温に戻してください。

  NOTE: Steps for live cell (no fixation) preparation should be performed in succession at room temperature to minimize stress on the cells. DNAの断片化を最小限にするため、再懸濁する場合には激しいボルテックスや気泡の混入を避けてください。生細胞のCUT&RUNサンプルを調製する場合、細胞が必要以上に放置される時間を最小化するため、細胞サンプルの調製を始める前にConcanavalin Aビーズ (セクションII、ステップ1 - 5) を調製することを推奨します。活性化したビーズは使用するまで氷上に保存してください。

1. 新たに培養した細胞を、細胞ストレスを最小限にするため室温で回収してください。各反応あたり5,000 - 100,000細胞を回収し、さらにインプットサンプルの調製用に5,000 - 100,000細胞を回収してください。Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751によるポジティブコントロールと、Rabbit (DA1E) mAb IgG XP ^®Isotype Control (CUT&RUN) #66362によるネガティブコントロールに用いるサンプルを忘れずに用意してください。

   NOTE: For adherent cells, the cells first need to be detached from the dish using Trypsin and neutralized with at least 3 volumes of tissue culture medium. スクレイパーを用いて培養皿から細胞を掻き取ると、ストレスの原因となり、細胞を溶解させてしまう場合もあるため、CSTはこれを推奨しません。適切な数の細胞を実験に用いるため、血球計算盤やその他の細胞計数装置で細胞数をカウントする必要があります。

2. 細胞懸濁液を600 x gで3分間、室温で遠心分離して、上清を除去してください。

   NOTE: The challenge of working with low cell numbers (<100,000 total cells) is that the centrifuged cell pellet is not always visible by eye, making it easy to lose cells during the wash steps. したがって、少数の細胞で実験を進める場合は下記ステップ3-5の洗浄ステップの省略を推奨します。懸濁液に40%の培地が混入していても Concanavalin Aビーズと細胞は結合します。このため、ステップ2の細胞懸濁液の初めの遠心分離の段階で上清の完全除去はせず、1反応当たり40 µL以下の培地を残す方法もあります。この場合、ステップ6で細胞懸濁液に適量の1X Wash Buffer (+ Spermidine + PIC) を加え、1反応あたりの合計容量を100 µLにしてください。

3. 1X Wash Buffer (+ Spermidine + PIC) 1 mLを室温で加え、ピペッティングで静かに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
4. 600 x gで3分間、室温で遠心分離して、液体を除去してください。
5. ステップ3と4を繰り返して、2度目の細胞ペレットの洗浄を実施してください。
6. 各反応またはインプットサンプルあたり、1X Wash Buffer (+ Spermidine + PIC) 100 µLを加え、ピペッティングで静かに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
7. 細胞100 µLを新しいチューブに移し取り、セクションVを実施するまで4°Cで保存してください。これがインプットサンプルです。

   NOTE: The input sample will be incubated at 55°C later in the protocol, so it is recommended to use a safe-lock 1.5 ml tube to reduce evaporation during the incubation.

8. 速やかにセクションIIに進んでください。

B.固定細胞サンプルの調製

NOTE: The following reagents are required for fixed cell preparation and are not included in this kit: 37% formaldehyde or 16% Formaldehyde Methanol-Free #12606, Glycine Solution (10X) #7005, and 10% SDS Solution #20533.

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&RUN反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012と100X Spermidine #27287を取り出して温めてください。両者とも必ず完全に解凍してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。
• 1X Wash Buffer (1細胞株あたり2 mL、1反応あるいは1インプットサンプルあたり追加で100 µL) を調製してください。例えば、1X Wash Buffer 2.5 mLを調製する場合、10X Wash Buffer #31415 250 µL + 100X Spermidine #27287 25 µL + 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 12.5 µL + Nuclease-free Water #12931 2212.5 µLを加えてください。細胞へのストレスを最小限にするため、室温に戻してください。
• 固定処理をする細胞懸濁液1 mLあたり、37% Formaldehydeを2.7 µLまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606を6.25 µL取り分け、室温で保持してください。使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。

1. 各抗体/MNase反応あたり5,000 - 100,000細胞を回収し、さらにインプットサンプルの調製用に5,000 - 100,000 細胞を回収してください。Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751によるポジティブコントロールと、Rabbit (DA1E) mAb IgG XP ^®Isotype Control (CUT&RUN) #66362によるネガティブコントロールに用いるサンプルを忘れずに用意してください。

   NOTE: With adherent cell lines, cells first need to be detached from the dish using Trypsin and neutralized with at least 3 volumes of medium. スクレイパーを用いて培養皿から細胞を掻き取ると、ストレスの原因となり、細胞を溶解させてしまう場合もあるため、CSTはこれを推奨しません。適切な数の細胞を実験に用いるため、血球計算盤やその他の細胞計数装置で細胞数をカウントする必要があります。

2. 細胞懸濁液1 mLあたり、37% Formaldehydeを2.7 µLまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606を6.25 µL加え、終濃度0.1%のホルムアルデヒド溶液としてください。チューブを転倒混和しながら室温で2分間インキュベートしてください。
3. 固定処理した細胞懸濁液1 mLあたり、Glycine Solution (10X) #7005を100 µL加え、クロスリンクを停止してください。チューブを転倒混和しながら室温で5分間インキュベートしてください。
4. 細胞懸濁液を3,000 x gで3分間、4°Cで遠心分離して、液体を除去してください。速やかにステップ5に進んでください。(SAFE STOP) 固定した細胞ペレットは、使用するまで-80°Cで6ヵ月間保存できます。

   NOTE: The challenge of working with low cell numbers (<100,000 total cells) is that the centrifuged cell pellet is not always visible by eye, making it easy to lose cells during the wash steps. この場合は細胞ペレットの凍結保存を推奨しません。また、このような少数の細胞で実験を進める場合は下記ステップ5 - 7洗浄操作を省略することを推奨します。懸濁液に40%の培地が混入していても Concanavalin Aビーズと細胞は結合します。このため、ステップ4の細胞懸濁液の初めの遠心分離の段階で上清の完全除去はせず、1反応当たり40 µL以下の培地を残す方法もあります。この場合、ステップ8で細胞懸濁液に適量の1X Wash Buffer (+ Spermidine + PIC) を加え、1反応あたりの合計容量を100 µLにしてください。

5. 1X Wash Buffer (+ Spermidine + PIC) 1 mLを加え、ピペッティングで静かに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
6. 3,000 x gで3分間、4°Cで遠心分離して、液体を除去してください。
7. ステップ5と6を繰り返して、2度目の細胞ペレットの洗浄を実施してください。
8. 各反応またはインプットサンプルあたり、1X Wash Buffer (+ Spermidine + PIC) 100 µLを加え、ピペッティングで静かに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
9. 細胞100 µLを新しいチューブに移し取り、セクションVを実施するまで4°Cで保存してください。これがインプットサンプルです。

   NOTE: The input sample will be incubated at 55°C later in the protocol, so it is recommended to use a safe-lock 1.5 ml tube to reduce evaporation during the incubation.

10. 速やかにセクションIIに進んでください。

C.組織サンプルの調製

ほとんどの組織タイプにおいて、軽く固定した (0.1%ホルムアルデヒドで2分間) 組織1 mgを用いることにより、ヒストンや転写因子、コファクターを安定して濃縮できます。ヒストン修飾の濃縮の場合は、ホルムアルデヒド固定は必須ではありません。しかし、多くの転写因子やコファクターの場合、軽く固定することで最適な結果が得られます。存在量の少ない、あるいは結合力の弱い転写因子やコファクターの場合、中程度の固定 (0.1%ホルムアルデヒドで10分間) が必要なこともあります。また、線維組織のような難しい組織を使用する場合には、中程度の固定によって結果が改善されることがあります。過剰な固定はCUT&RUNアッセイを阻害することにご注意ください。固定した組織は凍結し、使用するまで-80˚Cで6ヵ月間まで保存できます。

NOTE: When preparing fresh tissue (no fixation) for CUT&RUN, we recommend preparing the Concanavalin A Beads (Section II, Steps 1 to 5) prior to preparing the tissue as to minimize the amount of time the cells sit around during bead preparation. 活性化したビーズは使用するまで氷上に保存してください。

NOTE: The following reagents are required for fixed tissue preparation and are not included in this kit: 37% formaldehyde or 16% Formaldehyde Methanol-Free #12606, Phosphate Buffered Saline (PBS) #9872, Glycine Solution (10X) #7005, and 10% SDS Solution #20533.

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&RUN反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012と100X Spermidine #27287を取り出して温めてください。両者とも必ず完全に解凍してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。
• 1X Wash Buffer (各タイプの組織あたり3 mL、各反応あるいはインプットサンプルあたり追加で100 µL) を調製してください。例えば、1X Wash Buffer 3.5 mLを調製する場合、10X Wash Buffer #31415 350 µL + 100X Spermidine #27287 35 µL + 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 17.5 µL + Nuclease-free Water #12931 3097.5 µLを加えてください。細胞へのストレスを最小限にするため、室温に戻してください。
• 組織の固定が必要な場合は次のバッファーを調製してください：
  • 各組織あたり1 mLの固定バッファーを調製してください。固定バッファー1 mLあたり、Phosphate Buffered Saline (PBS) #9872 1 mLに、37% Formaldehydeを2.7 µLまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606を6.25 µL、200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012を5 µL加えてください。使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。
  • 各タイプの組織あたり、PBS #9872 1 mL + Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012 5 µLを調製し、氷上に置いてください。
  • 固定バッファー1 mLあたり、Glycine Solution (10X) #7005 100 µLを準備してください。

1. 各抗体/MNase反応あたり新鮮な組織を1 mg測り取り、さらにインプットサンプル調製用に1 mgを測り取ってください。Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751によるポジティブコントロールと、Rabbit (DA1E) mAb IgG XP ^®Isotype Control (CUT&RUN) #66362によるネガティブコントロールに用いるサンプルを忘れずに用意してください。

   NOTE: For some transcription factors or cofactors, or for difficult tissue types like fibrous tissues, up to 5 mg tissue per reaction can be used without scaling up reagents.

2. 組織サンプルをシャーレに置き、清潔な解剖用メスまたは剃刀の刃で細かく切り刻んでください。シャーレは氷上に置いてください。タンパク質分解を防ぐため、組織をよく冷やす必要があります。

   NOTE: We recommend light fixation of tissues because this condition works optimally for most tissue types and protein targets. しかし、新鮮な組織 (非固定) が望ましい場合は、ステップ3 - 8を省略して直ちにステップ9に進んでください。

3. 刻んだ組織を速やかに固定液1 mLに移し、チューブを転倒混和してください。

   NOTE: This volume of fixation solution is sufficient for up to 50 mg of tissue. 50 mgを超える組織を処理する場合は、固定液とステップ7の1X PBS+PIC液のスケールアップをしてください。

4. 室温で2分間インキュベートしてください。

   NOTE: For difficult tissue types (like fibrous tissues) or low abundance and/or weak binding transcription factors or cofactors, extending the formaldehyde fixation to 10 min may improve results.

5. 固定バッファー1 mLあたり 、10X Glycine #7005​​ 100 µLを加えてクロスリンクを停止させてください。チューブを転倒混和しながら室温で5分間インキュベートしてください。
6. 2,000 x gで5分間、4°Cで遠心分離して、液体を除去してください。
7. 1X PBS+PIC 1 mLに組織を再懸濁してください。
8. 2,000 x gで5分間、4°Cで遠心分離して液体を除去し、ステップ9に進んでください。(​​SAFE STOP​) 固定した組織ペレットは、ホモジナイズする前に-80℃で6ヵ月まで保存することができます。
9. 組織を1X Wash Buffer (+ Spermidine + PIC) 1 mLに再懸濁し、サンプルをダウンスホモジナイザーに移してください。
10. 組織片を、シングルセル懸濁液になるまで破砕してください。20-25ストロークで、組織の塊が見られなくなるまでホモジナイズしてください。
11. 細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、3,000 x gで3分間、室温で遠心分離して、細胞から上清を除去してください。
12. 細胞ペレットを1X Wash Buffer (+ Spermidine + PIC) 1 mLに再懸濁してください。
13. 細胞懸濁液を3,000 x gで3分間、室温で遠心分離して、上清を除去してください。
14. ステップ12と13を繰り返して、2度目の細胞ペレットの洗浄を実施してください。
15. 各反応あたり、1X Wash Buffer (+ Spermidine + PIC) 100 µLを加え、ピペッティングで静かに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
16. 細胞100 µLを新しいチューブに移し取り、セクションVを実施するまで4°Cで保存してください。これがインプットサンプルです。

    NOTE: The input sample will be incubated at 55°C later in the protocol, so it is recommended to use a safe-lock 1.5 ml tube to reduce evaporation during the incubation.

17. 速やかにセクションIIに進んでください。

II. Concanavalin Aビーズと一次抗体の結合

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&RUN反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• Digitonin Solution #16359を取り出して90 - 100°Cで5分間温め、完全に解凍されて溶解していることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359はすぐに氷上に置いてください。

  NOTE: Digitonin Solution #16359 should be stored at -20°C. 使用中は氷上に置き、使用が終了したら-20°Cで保管してください。

• 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012と100X Spermidine #27287を取り出して温めてください。両者とも必ず完全に解凍してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。
• Concanavalin A Bead Activation Bufferを氷上に置いてください。
• 1反応あたり、100X Spermidine #27287 1 µL + 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 0.5 µL + Digitonin Solution #16359 2.5 µL + Antibody Binding Buffer #15338 96 µLを調製し、氷上に置いてください (1反応あたり100 µL)。

1. Concanavalin A磁気ビーズを、ビーズ懸濁液がチューブからこぼれないように注意深くピペッティングで上下させて再懸濁してください。CUT&RUN1反応あたりビーズ懸濁液10 µLを、新しい1.5 mLチューブに移してください。

   NOTE: Avoid vortexing the Concanavalin A Magnetic Bead suspension as repeated vortexing may displace the Concanavalin A from the beads.

2. ビーズ懸濁液10 µLにつきConcanavalin A Bead Activation Buffer 100 µLを加えてください。ピペッティングで穏やかに上下させてビーズを混合してください。
3. チューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後、上清を取り除いてください。

   NOTE: To avoid loss of beads, remove liquid using a pipet. 真空吸引はしないでください。

4. チューブを磁気ラックから外してください。ステップ2と3をもう1度繰り返し、2度目のビーズの洗浄を実施してください。
5. ビーズ懸濁液の最初の量と同量 (サンプルあたり10 µL) のConcanavalin A Bead Activation Bufferを加えて、ピペッティングで上下させて再懸濁してください。

   NOTE: If Concanavalin A Beads are prepared prior to cell or tissue preparation, as recommended for live cells and fresh tissue, the activated beads can be stored on ice until use.

6. Concanavalin Aビーズが溶液中でよく懸濁されていることを確認してください。セクションI-A ステップ8、セクションI-B ステップ10、またはセクションI-C ステップ 17で調製し、洗浄した細胞懸濁液に、活性化したビーズ懸濁液を1反応あたり10 µL加えてください。
7. ピペッティングで上下させてサンプルを十分に混合してください。室温で5分間インキュベートしてください。

   NOTE: Concanavalin A Magnetic Beads may clump or stick to the sides of the tube. ビーズはピペッティングで上下させて再懸濁してください。サンプルチューブの振盪は不要です。

8. チューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後、上清を取り除いてください。
9. チューブを磁気ラックから外してください。1反応あたりAntibody Binding Buffer (+ Spermidine + PIC + Digitonin) 100 µLを加えて、氷上に置いてください。
10. 細胞とビーズの懸濁液100 µLを1反応分として、別々の1.5 mLチューブに分注して氷上に置いてください。
11. 各チューブに適量の抗体を加えて、ピペッティングで上下させて静かに混合してください。

    NOTE: The amount of antibody required for CUT&RUN varies and should be determined by the user. ポジティブコントロールのTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mA #9751は、抗体2 µLをサンプルに加えてください。ネガティブコントロールのRabbit (DA1E) mAb IgG XP^® Isotype Control (CUT&RUN) #66362は、抗体5 µLをサンプルに加えてください。「抗体なし」のコントロールではMNaseによる非特異的な消化が高レベルにみられ、バックグラウンドが高くなるため、ネガティブコントロール抗体を使用することを強く推奨します。qPCR解析とNG-seq解析の両方で比較するため、インプットサンプルを使用することを推奨します。

12. チューブを4°Cで2時間、インキュベートしてください。このステップは一晩まで延長できます。

    NOTE: Concanavalin A Magnetic Beads may clump or stick to the sides of the tube. ビーズはピペッティングで上下させて再懸濁してください。サンプルチューブの振盪は不要です。

III. pAG-MNase Enzymeの結合

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&RUN反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• Digitonin Solution #16359を取り出して90 - 100°Cで5分間温め、完全に解凍されて溶解していることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359はすぐに氷上に置いてください。

  NOTE: Digitonin Solution #16359 should be stored at -20°C. 使用中は氷上に置き、使用が終了したら-20°Cで保管してください。

• 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012と100X Spermidine #27287を取り出して温めてください。両者とも必ず完全に解凍してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。
• 1反応あたり、Digitonin Bufferを3.2 mL (10X Wash Buffer #31415 320µL + 100X Spermidine #27287 32 µL + 200X Protease Inhibitor Cocktail #7012 16 µL + Digitonin Solution #16359 80 µL + Nuclease-free Water #12931 2.752 µL) 調製してください。

  NOTE: The Digitonin Buffer prepared here will be used for both Section III and IV.

• 新しいチューブに、1反応あたりDigitonin Buffer (上記) 50 µLとpAG-MNase Enzyme 1.5 µLを加え、pAG-MNase液を調製してください。例えば反応10回分の場合、Digitonin Buffer 500 µLを新しいチューブに移し、pAG-MNase Enzyme 15 µLを加えてください。ピペッティングで上下させて混合し、氷上に置いてください。

1. セクションII、ステップ12のチューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後、液体を除去してください。
2. チューブを磁気ラックから外し、Digitonin Buffer (+ Spermidine + PIC + Digitonin) 1 mLを加えてください。チューブの壁に張り付いたビーズを確実に回収できるように、穏やかに上下にピペッティングしてビーズを再懸濁してください。
3. チューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後、液体を除去してください。
4. チューブを磁気ラックから外してください。各チューブにpAG-MNase溶液50 µLを加えて、ピペッティングで静かに上下させてサンプルを混合してください。
5. チューブを4°Cで1時間、インキュベートしてください。

   NOTE: Concanavalin A Magnetic Beads may clump or stick to the sides of the tube. ビーズはピペッティングで上下させて再懸濁してください。サンプルチューブの振盪は不要です。

6. 速やかにセクションIVに進んでください。

IV. DNAの消化と拡散

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&RUN反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• Digitonin Solution #16359を取り出して90 - 100°Cで5分間温め、完全に解凍されて溶解していることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359はすぐに氷上に置いてください。

  NOTE: Digitonin Solution #16359 should be stored at -20°C. 使用中は氷上に置き、使用が終了したら-20°Cで保管してください。

• Calcium Chlorideを氷上に置いてください。
• セクションIで固定したサンプルを用いる場合は、10% SDS Solution #20533が完全に溶解していることを確認してください。37°Cに温めることでSDSの沈殿が溶解し易くなります。
• 1反応あたり、1X Stop Bufferを150 µL (4X Stop Buffer #48105 37.5 µL + Digitonin Solution #16359 3.75 µL + RNAse A #7013 0.75 µL + Nuclease-free Water #12931 108 µL) 調製してください。

  Optional: Sample Normalization Spike-In DNA can be added into the 1X Stop Buffer if sample normalization is desired (for example, see Figure 8 in Section VII). qPCR解析の場合、1反応あたりSpike-In DNAを5 µL (5 ng) 加えることを推奨します。NG-seq解析の場合、Sample Normalization Spike-In DNAをNuclease-free Water #12931で100倍希釈してから、1反応あたりSpike-In DNAを5 µL (50 pg) 加えることを推奨します。1反応あたり100,000細胞または1 mgの組織を用いた場合、これによって標準化 (Spile-In) のリード数が全シーケンシングリード数の約0.5%となります。1反応あたりに用いた細胞数や組織重量が100,000 (細胞) または1 mg (組織) より多い場合や少ない場合は、標準化のリード数が全リード数の約0.5%になるように、比例計算でSample Normalization Spike-In DNAの用量を調整してください。

1. セクションIII、ステップ6のチューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後、液体を取り除いてください。
2. チューブを磁気分離ラックから外してください。セクションIIIで調製したDigitonin Buffer (+ Spermidine + PIC + Digitonin) 1 mLを加え、ピペッティングで穏やかに上下させてビーズを再懸濁してください。
3. ステップ2-3をもう1度繰り返してください。
4. チューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後、液体を除去してください。
5. チューブを磁気ラックから外してください。各チューブに、セクションIIIで調製したDigitonin Buffer (+ Spermidine + PIC + Digitonin) を 150µL加え、ピペッティングで上下させて混合してください。
6. 酵素消化を開始する前にチューブを氷上に5分間置いてください。
7. 各チューブに冷却したCalcium Chlorideを3 µL加え、ピペッティングで上下させて混合し、pAG-MNaseを活性化してください。
8. サンプルを4°Cで30分間インキュベートしてください。

   NOTE: Digestion should be performed in a 4°C cooling block or refrigerator. 氷の温度は0°Cまで下がることがあり、これによって消化が制限されシグナルが低減する可能性があります。サンプルチューブの振盪は不要です。

9. 各サンプルに1X Stop Buffer (+ Digitonin + RNAse A + Spike-in DNA [オプション]) を150 µL加え、ピペッティングで上下させて混合してください。
10. チューブを振盪せずに37°Cで10分間インキュベートして、DNA断片を溶液中に放出させてください。
11. 16,000 x gで2分間、4°Cで遠心分離して、チューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置いてください (30秒間から2分間)。
12. 上清を新しい2 mLマイクロ遠心チューブに移してください。これが濃縮クロマチンサンプルになります

    NOTE: If live cells or fresh tissues (not fixed) are used for the CUT&RUN assay, skip Steps 14-15 and immediately proceed to Step 16.

    NOTE: Fixed samples will be incubated at 65°C later in the protocol, so it is recommended to use a safe-lock 2 ml tube to reduce evaporation during the incubation.

13. 固定した細胞または組織サンプルの脱クロスリンクを行うため、サンプルを室温まで温め、各サンプルに10% SDS Solution #20533を3 µL (終濃度0.1%)、Proteinase K (20 mg/mL) #10012を2 µL加えてください。

    NOTE: SDS may precipitate out of solution if samples are not pre-warmed to room temperature.

14. 各サンプルをボルテックスで混和し、65℃で少なくとも2時間インキュベートしてください。インキュベーションは一晩まで延長することができます。インキュベーション後、サンプルを10,000x gで1秒間遠心して、チューブのキャップから蒸発した液を落としてください。
15. サンプルの温度を室温に平衡化した後、セクションVIに進んでください。(​​SAFE STOP​) ここでサンプルを-20℃で1週間まで保存することができます。ただし、DNAの精製 (セクションVI) に移る前に、サンプルを必ず室温まで温めてください。

V.インプットサンプルの調製

下流解析でNG-sequencingを行う場合はライブラリーを調製するためにインプットDNAの断片化が必要ですが、下流解析がqPCRの場合は必須ではありません。ソニケーターを利用できない場合、qPCR解析にはインプットDNAを断片化せずに使用することを推奨しますが、断片化していないインプットDNAはサイズが大きすぎてDNAスピンカラムで精製できないので、フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿で精製する必要があります。ソニケーターが利用できず、下流解析でNG-sequencingが必要な場合は、正常IgGを用いたCUT&RUNサンプルをネガティブコントロールとして使用することもできますが、正常IgGでは非特異的にDNAが濃縮される場合があり、理想的ではありません。代替法として、MNaseを利用してインプットDNAを断片化するプロトコールをhttps://cst-science.com/CUT-RUN-input-digestionで公開しています。

! すべてのバッファーの量は、調製するインプットサンプルの数に比例して増加させる必要があります。

実験開始前の準備：

• DNA Extraction Buffer #42015を取り出して温めてください。必ず完全に解凍してください。
• インプット1サンプルあたり、次の混合液を調製してください：Proteinase K #10012 2 µL + RNase A #7013 0.5 µL + DNA Extraction Buffer #42015 197.5 µL (インプット1サンプルあたり、合計200 µL)。

1. セクションI-A ステップ7、セクションI-B ステップ9、またはセクションI-C ステップ16からのインプットサンプル100 µLに、DNA Extraction Buffer (+ Proteinase K + RNase A) 200 µLを加えてください。ピペッティングで上下させて混合してください。
2. チューブを55°Cで振盪しながら1時間インキュベートしてください。
3. チューブを氷上に5分間置いて、サンプルを完全に冷却してください。
4. インプットサンプルをソニケーションすることにより、細胞を溶解してクロマチンを断片化してください。ソニケーション処理の合間は、サンプルを氷上に30秒間置いてください。

   NOTE: Sonication conditions may need to be determined empirically by testing different sonicator power settings and/or durations of sonication, following the protocol in Appendix B. 最適なソニケーション条件では、クロマチン断片のサイズが100-600 bpの範囲になります。VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicatorで1/8インチプローブを用いた場合、出力設定6、15秒パルスを5セット行うことで、インプットクロマチンは十分に断片化されます。

5. 18,500​ x gで10分間、4°Cで遠心分離して、溶解物を清澄化してください。上清を新しい2 mLチューブに移してください。
6. 速やかにセクションVI (DNAの精製) に進んでください。(​​SAFE STOP​) ここでサンプルを-20℃で1週間まで保存することができます。ただし、DNAの精製 (セクションVI) に移る前に、サンプルを必ず室温まで温めてください。

VI. DNAの精製

DNAスピンカラム (セクションVI-A) または、フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿 (セクションVI-B) で、インプットや濃縮クロマチンサンプルからDNAを精製してください。DNAスピンカラムを用いた精製は簡便かつ迅速で、35 bp以上のDNA断片を効率良くに回収できます (図7A、レーン2)。フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿による精製は比較的煩雑ですが、35 bp以下のDNA断片も回収できます (図7A、レーン3)。ただし、図7Bに示したように、CUT&RUNアッセイで得られるほとんどのDNA断片は、35 bp以上になります。このため、DNAスピンカラムはCUT&RUN反応による全DNA断片の98%以上を精製する、迅速かつ簡便な方法と言えます。

精製したDNAはNG-seq解析に進む前に、PicoGreenによるDNA定量アッセイによって定量できます。100,000細胞を用いたCUT&RUN反応で期待されるDNAの収量は、転写因子やコファクターの場合は1反応あたり0.5-10 ng、ヒストン修飾の場合は1反応あたり1-20 ngです。

図 7 DNA精製にスピンカラムを用いた場合と、フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿を用いた場合を比較しました。(A) 低分子量のDNAラダー混合物 (レーン1、未精製) を、DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP、CUT&RUN、CUT&Tag) #14209 (レーン 2)、あるいは、フェノール/クロロホルム抽出とそれに続くエタノール沈殿 (レーン3) により精製し、4%アガロースゲルでの電気泳動により分離しました。ここで示したように、フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿はすべてのサイズのDNA断片を効率的に回収し、DNAスピンカラムは35 bp以上のDNA断片を回収できます。(B) TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569を用いたCUT＆RUNアッセイで得られたDNAを、フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿で精製しました。ライブラリーのDNA断片のサイズを、Bioanalyzer (Agilent Technologies) を用いて解析しました。ライブラリーの構築で付加されたアダプター配列とバーコード配列の断片の長さは140 bpです。したがって、35 bpのDNA断片から始めると、ライブラリーの調製後には175 bpになります (図では青の垂直線で表示)。ここで示したように、断片の長さが175 bp以下 (開始長は35 bp以下) なのはCUT&RUN反応による全濃縮DNA断片の2%以下で、これは、スピンカラムを用いたDNA精製により、CUT&RUN反応による全DNA断片の98%以上が得られることを示唆しています。

A. スピンカラムを用いたDNAの精製

NOTE: DNA can be purified from input and enriched chromatin samples using the DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN, CUT&Tag) #14209 (not included in this kit) and the modified protocol below. インプットクロマチンサンプルと濃縮クロマチンサンプル300 µLに5倍量 (1.5 mL) のDNA Binding Bufferを加える点を踏まえ、ステップ1から5までを修正しました。

実験開始前の準備：

• !! 使用前に、DNA Wash Bufferにエタノール (96-100%) 24 mLを加えてください。このステップは、DNA精製の最初のセッティングの前に1度だけ実施してください。
• 精製する濃縮クロマチンまたはインプット1サンプルあたり、DNA Purification Collection Tubeを1つ取り出してください。

1. 各インプットサンプルまたは濃縮クロマチンサンプルにDNA Binding Buffer 1.5 mLを加え、ピペッティングで上下させて混合してください。

   NOTE: 5 volumes of DNA Binding Buffer should be used for every 1 volume of sample.

2. ステップ1のサンプル600 μLを、コレクションチューブにセットしたDNAスピンカラムに移してください。
3. 18,500​ x gで30秒間遠心分離してください。
4. コレクションチューブからスピンカラムを取り外し、液体を廃棄してください。空になったコレクションチューブにスピンカラムを再セットしてください。
5. ステップ2-4を繰り返し、ステップ1のサンプル (1.5 mL) をすべてカラムにロードしてください。空になったコレクションチューブにスピンカラムを再セットしてください。
6. DNA Wash Buffer 750 μLを、コレクションチューブにセットしたスピンカラムに加えてください。
7. 18,500​ x gで30秒間遠心分離してください。
8. コレクションチューブからスピンカラムを取り外し、液体を廃棄してください。空になったコレクションチューブにスピンカラムを再セットしてください。
9. 18,500​ x gで30秒間遠心分離してください。
10. コレクションチューブと液体を廃棄してください。スピンカラムは廃棄しないでください。
11. スピンカラムにDNA Elution Buffer 50 μLを加え、新しい1.5 mLチューブにセットしてください。
12. 18,500​ x gで30秒間遠心分離して、DNAを溶出してください。
13. DNAスピンカラムを取り外し、廃棄してください。得られた溶出液が精製されたDNAです。(​​SAFE STOP​) サンプルは-20℃で6​ヵ月まで保存することができます。

B. フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿を使用したDNAの精製

NOTE: The following reagents are required for the phenol/chloroform extraction and ethanol precipitation and are not included in this kit: phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1), chloroform/isoamyl alcohol (24:1), 3M Sodium Acetate (pH 5.2), 20mg/ml glycogen, 100% ethanol, 70% ethanol, and 1X TE buffer or Nuclease-free Water #12931.

1. フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (25:24:1) 300 μLをインプットサンプルと濃縮クロマチンサンプルに加え、30秒間ボルテックスして十分に混合してください。
2. 16,000 x gで5分間遠心分離して、層に分離してください。上部の水層の大部分を (中間層を避けて) 注意深く新しいチューブに移してください。
3. クロロホルム/イソアミルアルコール (24:1) 300 μLを水層サンプルに加え、30秒間ボルテックスして十分に混合してください。
4. 16,000 x gで5分間遠心分離して、層に分離してください。上部の水層の大部分を (中間層を避けて) 注意深く新しいチューブに移してください。
5. 3 M酢酸ナトリウム (pH 5.2) 25 µL、20 mg/mLグリコーゲン1 µL、100%エタノール600 µLを水層サンプルに加え、30秒間ボルテックスして混合してください。
6. -80°Cに1時間、あるいは、-20°Cに一晩置いて、DNAを沈殿させてください。
7. 4℃、16,000 x gで5分間遠心分離して、DNAをペレットにしてください。
8. 上清を注意深く除去し、70%エタノールでペレットを洗浄してください。
9. 4℃、16,000 x gで5分間遠心分離して、DNAをペレットにしてください。
10. 上清を除去し、ペレットを風乾してください。
11. 1X TEバッファーまたはNuclease-free Water #12931 50 µLにペレットを再懸濁してください。これが精製されたDNAです。(​​SAFE STOP​) サンプルは-20℃で6​ヵ月まで保存することができます。

VII. qPCRによるDNAの定量

推奨事項：

• 本キットに含まれるSample Normalization Primer Setは出芽酵母のACT1遺伝子を増幅するプライマーセットで、酵母に由来するSample Normalization Spike-In DNAを定量してサンプルを標準化することができます。
• 本キットにはコントロールプライマーとしてヒトまたはマウスのRPL30遺伝子を増幅するプライマーセット (#7014または#7015) が含まれており、Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751を用いた濃縮クロマチンサンプルの定量的リアルタムPCRに使用できます。他の生物種でCUT&RUNを実施する場合は、その生物種に適切なコントロールプライマーを設計し、最適なPCR条件を決定してください。
• プライマーの設定は非常に重要です。CUT&RUNの場合、PCR増幅産物のサイズは約60-80 bpとなるのが望ましいです。プライマーをデザインする場合、融解温度は約60°C、GC含量は約50%が最適です。
• qPCRでヒストンや転写因子、コファクターの標的遺伝子を定量する場合、qPCRに用いる精製DNAは2 µLで十分です。
• 非特異的なPCR産物の増幅を防ぐため、ホットスタート用Taqポリメラーゼの使用を推奨します。
• コンタミネーションを防ぐため、ピペットチップはフィルター付きのものを使用してください。

1. 使用するPCR装置のモデルに対応するPCRチューブあるいはPCRプレートに、適切なサンプル番号を記載してください。PCR反応には、ポジティブコントロールのtri-methyl-histone H3 Lsy4サンプル、ネガティブコントロールのRabbit IgGサンプル、DNAコンタミネーションに対するコントロールとしてDNAなしのチューブ、インプットDNAサンプルを含めてください。必要であれば、インプットDNAの段階希釈 (未希釈 - 100%インプット、1:5 - 20%インプット、1:25 - 4%インプット、1:125 - 0.8%インプット) を使用して標準曲線を作成し、増幅の効率を決定し、各免疫濃縮サンプル内のDNAの量を定量化することができます。

   NOTE: If sample normalization is performed, only the CUT&RUN samples are to be analyzed using the Sample Normalization Primer Set. インプットDNAにNormalization Spike-In DNAは含まれません。

2. PCRチューブあるいはPCRプレートのウェルに、適切なDNAサンプル2 μLを加えてください。
3. 以下のように、マスターミックスを調製してください。各PCRに2-3の複製反応 (DupulicateまたはTriplicate) を設定してください。分量の損失を考慮して、十分量のマスターミックスを調製してください (1-2反応分を余計に調製するなど)。各PCRチューブあるいは各ウェルにマスターミックス18 μLを加えてください。

試薬	PCR反応1回分の分量 (18 μL)
Nuclease-free H2O #12931	6 µL
5 µMのプライマー	2 µL
SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989	10 µL

4. PCR反応を以下のプログラムで開始してください：

a.	初期変性	95°Cで3分間
b.	変性	95°Cで15秒間
c.	アニーリングおよび伸長	60°Cで60秒間
d.	ステップb - cの繰り返し (合計40サイクル)

5. リアルタイムPCR装置に付属のソフトウェアを使用して、定量結果を解析してください。代替法として、Percent Input法により下記の公式を用いて、免疫沈降の効率を算出することもできます。この方法では、各抗体反応で回収されたシグナルを、インプットクロマチン総量の割合 (%) で示します。インプットDNAサンプルの段階希釈を使用する場合、% Input (100%、20%、4%、0.8%) のLog(10) に対する標準曲線をプロットし、使用して各抗体反応で得られたシグナルを計算します。
• Percent Input = 100% x 2^{(C[T] 100%Input Sample - C[T] IP Sample)}
• C[T] = C_T = PCR反応の平均閾値サイクル
6. サンプルの標準化を行う場合、Sample Normalization Primer SetのC[T]値が最も低いサンプルを選択し (例えば、下表のサンプル1)、次の公式を使用してその他のサンプルの標準化係数を算出してください。それぞれの標準化係数を使用して、使用したプライマーセットで得られたシグナルを補正してください。

qPCR解析におけるサンプルの標準化の例 (図8を参照)

	Sample Normalization Primer SetのC[T] 値	**qPCRの標準化係数	標準化前のシグナル (ステップ5で算出したPercent Input)	標準化後のシグナル
サンプル1	23.31	2(23.31-23.31)=1.00	24.4%	24.4%/1.00=24.4%
サンプル2	24.24	2(23.31-24.24)=0.52	12.0%	12.0%/0.52=23.1%
サンプル3	25.08	2(23.31-25.08)=0.29	6.28%	6.28%/0.29=21.7%
サンプル4	26.30	2(23.31-26.30)=0.13	2.72%	2.72%/0.13=20.9%

**qPCRの標準化係数 = 2 ^{(C[T] 選択したサンプル –C[T] その他のサンプル)}

図 8 qPCR解析におけるSpike-In DNAを用いたCUT&RUNシグナルの標準化。細胞数の異なるHCT116細胞を用い、Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 (上パネル) またはPhospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499 (下パネル) でCUT&RUNを実施しました。濃縮されたDNAを、SimpleChIP^® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516、SimpleChIP^® Human β-Actin Promoter Primers #13653、SimpleChIP^® Human Β-Actin 3' UTR Primers #13669、SimpleChIP^® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490を用いたリアルタイムPCRで解析しました。各サンプルで回収されたDNAの量を、100,000細胞のインプットクロマチン総量 (1に相当) に対する相対量で示しました。標準化前の濃縮結果を左のパネルに示しました。最初の細胞数に比例させた量のSample Normalization Spike-In DNAを、各反応に加えました。各サンプルのSpike-In DNAのqPCR結果に基づき、CUT&RUNシグナルを100,000細胞のサンプルで標準化しました。標準化後の濃縮結果を右のパネルに示しました。

VIII. NG-seqライブラリーの調製

CUT&RUNキットを用いて調製したDNAサンプルは、直接NG-seqに使用できます。NG-seq用のDNAライブラリーの調製には、下流のシーケンシングプラットフォームに対応するプロトコールやキットを使用してください。Illumina^®プラットフォームによるシーケンシングの場合は、DNA Library Prep Kit for Illumina^® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795を、Multiplex Oligos for Illumina^® (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580または#47538と共に、CUT&RUN DNAのプロトコールに従って使用することを推奨します。

• CUT&RUNのバックグラウンドシグナルは非常に低く、通常はヒストン修飾や転写因子の解析のシーケンシング深度は、1サンプルあたり500万リードで十分です。シーケンシング深度が1サンプルあたり1,500万以上の場合、リードの重複率が大幅に上昇します。シーケンシング深度が1サンプルあたり200万以下の場合、S/N比が低下します。
• 使用した細胞数が20,000未満の場合は、一般にNGSで得られるリードのマッピング率が低下し、重複率が上昇します。このような場合、下流のデータ解析に十分なユニークマップされたリードを得るため、シーケンシング深度を上げることを推奨します。
• サンプルの標準化を行う場合、全てのサンプルのCUT&RUNシーケンシングデータを、解析対象のリファレンスゲノム (ヒトなど) とサンプルの標準化に用いる酵母ゲノムの両方にマッピングしてください。酵母でユニークリード数が最も少ないサンプルを選択し (例えば、以表のサンプル1)、次の公式を使用してその他のサンプルの標準化係数を算出してください。それぞれの標準化係数を使用して、各サンプルの解析対象のリファレンスゲノムにアライメントしたユニークリード数を補正してください。その後のNGS解析には、補正後のデータセットを使用してください。

NGS解析におけるサンプルの標準化の例

	酵母にアラインメントしたユニークリード数	NGSの標準化係数	解析対象のリファレンスゲノムにアラインメントしたユニークリード数 (標準化前)	解析対象のリファレンスゲノムにアラインメントしたユニークリード数 (標準化後)
サンプル1	219,275	219,275/219,275 = 1.00	5,077,747	5,077,747 X 1.00 = 5,077,747
サンプル2	411,915	219,275/411,915 = 0.53	9,896,671	9,896,671 X 0.53 = 5,268,306
サンプル3	816,235	219,275/816,235 = 0.27	17,842,773	17,842,773 X 0.27 = 4,793,320
サンプル4	1,120,826	219,275/1,120,826 = 0.20	23,836,679	23,836,679 X 0.20 = 4,663,339

NGSの標準化係数 = 選択したサンプルの酵母のユニークリードの数 / その他のサンプルの酵母のユニークリードの数

APPENDIX A: Determination of Cell Sensitivity to Digitonin

CUT&RUNプロトコールでは、ジギトニンをバッファーに添加することで細胞膜を透過化し、一次抗体やpAG-MNaseの細胞や核への進入を促進します。このため、バッファーが適量のジギトニンを含むことは、抗体と酵素の結合および標的ゲノム遺伝子座の消化に不可欠です。異なる細胞株は、ジギトニンの細胞透過化に対して異なる感受性を示します。本プロトコールで推奨されているジギトニンの量は、ほとんどの細胞株や組織の透過化に十分ですが、下記のプロトコールを用いて、使用する特定の細胞株や組織のジギトニン感受性試験を行うことができます。過剰なジギトニンの添加はアッセイに対して有害ではないことが分かっていますので、濃度曲線を作成する必要はありません。推奨されるジギトニンの量が使用する細胞株に十分かどうかを、簡単な試験により判断します。

実験開始前の準備：

• Digitonin Solution #16359を取り出して、90-100°Cで5分間温めてください。必ず完全に解凍してください。解凍したDigitonin Solution #16359はすぐに氷上に置いてください。

  NOTE: Digitonin Solution #16359 should be stored at -20°C. 使用中は氷上に置き、使用が終了したら-20°Cで保管してください。

• 各細胞または組織サンプルあたり、Wash Bufferを100 µL (10X Wash Buffer #31415 10 µL + Nuclease-free Water #12931 90 µL) 調製してください。この試験では、スペルミジンやProtease Inhibitor Cocktailを加える必要はありません。

1. 1.5 mLチューブに10,000 - 100,000細胞を回収してください。組織の場合は、1 mgの組織から解離させた細胞を回収してください (セクションI-Cステップ1-13)。
2. 600 x gで3分間、室温で遠心分離して、液体を除去してください。

   NOTE: If the cell pellet is not visible by eye, we recommend removing as much cell medium as possible without disturbing the cell pellet after the initial centrifugation of the cell suspension in Step 2 and leave behind some cell medium per reaction. 続くステップ3で、適量の1X Wash Bufferを加え、細胞懸濁液の総量を100 µLにしてください。

3. Wash Buffer 100 µLに細胞ペレットを再懸濁してください。
4. 1反応あたり、 Digitonin Solution #16359を2.5 µL加え、室温で10分間インキュベートしてください。
5. 細胞懸濁液10 µLと0.4% Trypan Blue 10 µLを混合してください。
6. 血球計算盤またはセルカウンターを使用して、染色された細胞数と総細胞数を計測してください。透過化が十分であれば、90%以上の細胞がTrypan Blueで染色されます。
7. Trypan Blueで染色された細胞数が90%未満の場合は、バッファーに加えるDigitonin Solution #16359 の量を増加させて、90%以上の細胞が透過化され染色されるまでステップ1 - 5を繰り返してください。セクションI-IVでは、この量のDigitonin Solution #16359を使用してください。

APPENDIX B: Sonication Optimization for the Input Sample

DNAスピンカラムを使用して精製できるのは、10 kb以下に断片化されたゲノムDNAだけであることから、インプットDNAサンプルのソニケーションを推奨します。1 kb以下に断片化されたゲノムDNAは、NG-seq解析でネガティブコントロールとして使用できます。インプットDNAの長さが100-600 bpになるように、ソニケーションを最適化する必要があります。

NG-seqのコントロールには、インプットサンプルを使用することを推奨します。インプットサンプルは、偏りのない細胞ゲノムの代表として簡便に使用できるからです。IgGサンプルもNG-seqのネガティブコントロールとして使用できますが、非特異的な結合によりゲノムの特定領域で濃縮が見られる場合があります。qPCR解析の場合は、インプットDNAを断片化せずに使用することができます。ただし、断片化されていないDNAは、フェノール・クロロホルム抽出とエタノール沈殿によって精製する必要があります。

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、調製するインプットサンプルの数に比例して増加させる必要があります。

• DNA Extraction Buffer #42015 を取り出して室温で温め、完全に解凍されて溶解していることを確認してください。
• インプット1サンプルあたり、1X Wash Bufferを2.1 mL (10X Wash Buffer #31415 210 µL + Nuclease-free Water #12931 1.89 mL) 調製し、細胞へのストレスを最小限にするため、室温に戻してください。このWash Bufferには、スペルミジンやProtease Inhibitor Cocktail #7012を加える必要はありません。
• インプット1サンプルあたり、次の混合液を調製してください： Proteinase K #10012 2 µL + RNAse A #7013 0.5 µL + DNA Extraction Buffer #42015 197.5 µL (インプット1サンプルあたり200 µL)

1. 1.5 mLチューブ中に、検討するソニケーションの各条件に対して、CUT&RUN実験で使用するインプットと同じ数の細胞 (5,000 - 100,000細胞) を回収してください。組織の場合、各ソニケーション条件あたり、CUT&RUN実験で使用するインプットと同じ量の組織から解離させた細胞を回収してください (セクションI-C ステップ1-13)。
2. 600 x gで3分間、室温で遠心分離して、液体を除去してください。

   NOTE: If the centrifuged cell pellet is not visible by eye when working with low cell numbers (<100,000 cells), we recommend skipping the wash steps 3-5 below. ステップ2で細胞懸濁液を最初に遠心分離した後、ペレットを崩さない程度になるべく多くの培地を除去し、培地をいくらか残すことを推奨します。この場合、ステップ6で細胞懸濁液に適量の1X Wash Bufferを加え、各ソニケーション条件あたりの合計容量を100 µLにしてください。

3. 1X Wash Buffer 1 mLを加えて、ピペッティングで静かに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
4. 600 x gで3分間、室温で遠心分離して、液体を除去してください。
5. ステップ3と4を繰り返して、もう1度細胞ペレットを洗浄してください。
6. 各ソニケーション条件あたり、1X Wash Buffer 100 µLを加え、穏やかにピペッティングで上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
7. 細胞懸濁液100 µLを、各ソニケーションの条件ごとに新しいチューブに分注してください。

   NOTE: Samples will be incubated at 55°C in Step 9, so it is recommended to use a safe-lock 1.5 ml tube to reduce evaporation during the incubation.

8. 各サンプルにDNA Extraction Buffer (+ Proteinase K + RNAse A) 200 µLを加えて、ピペッティングで上下させて混合してください。
9. チューブを55°Cで振盪しながら、1時間インキュベートしてください。
10. チューブを氷上に5分間置いて、サンプルを完全に冷却してください。
11. お使いのソニケーターでの最適なソニケーション条件を決定するには、15秒間のパルスソニケーションのサイクル数を増加させながら、タイムコース実験を実施してください。ソニケーション処理の合間は、サンプルを氷上に30秒間置いてください。
12. 18,500​ x gで10分間、4°Cで遠心分離して、ライセートを清澄化してください。上清を新しい2 mLチューブに移してください。
13. セクションVIに従って、DNAスピンカラム、またはフェノール・クロロホルム抽出とエタノール沈殿で、DNAサンプルを精製してください。
14. カラムからDNAを溶出するか、DNAペレットを1X TEバッファーまたはNuclease-free Water #12931 30 µLに再懸濁してください。
15. 電気泳動でDNA断片のサイズを決定してください。100 bp DNAマーカーと共に15 µL以上のサンプルを、1%アガロースゲルにロードしてください。ゲル上のDNAスメアを観察するため、色素フリーのローディングバッファー (30% グリセロール) の使用を推奨します。
16. 最適なサイズである100-600 bpのDNA断片が得られるソニケーション条件を選択して、セクションV ステップ4のインプットサンプルの調製を実施してください。最適なソニケーション条件が得られない場合は、ソニケーターの出力設定あるいはソニケーションのサイクル数を増減させて、ソニケーションのタイムコース実験を繰り返してください。

APPENDIX C：トラブルシューティングガイド

詳細なトラブルシューティングガイドについては、https://cst-science.com/troubleshooting-CUT-RUNをご覧ください。