SignalStar^™ mIHCパネルデザイン

始める前に...

SignalStar Multiplex IHC技術では、特異的な一次抗体と蛍光検出試薬を用いて、FFPE組織サンプルの細胞タンパク質を標識します。高度に検証された抗体パネルを用いた、空間生物学実験用のこの技術により、複数のバイオマーカーを同時に定量できます。

自動でパネルデザインを設計するSignalStar Multiplex IHCパネルビルダーを活用することにより、抗体と蛍光色素の正確な組み合わせを検討する時間を省略できます。実験デザインは、4つの基本的なステップで設計可能であり、標的の種や使用する抗体、組み合わせる蛍光色素、設定するイメージングラウンドを迅速かつ簡単に選択できます。または、種や抗体を選択した後、これら以外の選択項目をパネルビルダーが自動で設計した提案に従うこともできます。

お手持ちのイメージング装置との適合性を確認

• SignalStar Multiplex IHCプロトコールは、手動で行うこともLeica Biosystems社のBOND RX自動染色装置を用いて自動で行うこともできます。詳細なイメージング装置の要件に関しては、プロトコールを参照してください。
  • 手動プロトコール
  • BOND RXプロトコール
• スペクトルの漏れ込みを回避して最高の結果を取得するためには、お手持ちの蛍光イメージング装置のスペクトル特性を考慮してください。
• 最終的なパネルに、DAPIの他に4種類の蛍光チャンネルが含まれる場合は、蛍光イメージング装置がこれらのチャンネルを特異的に検出し、以下のパラメーターに基づいて分離可能であることを確認する必要があります。

SignalStar Multiplex IHCパネルのデザイン方法

ステップ1：標的の種を選択する

SignalStar Multiplex IHCに用いる抗体は、表示されている種との特異的な交差性について検証済みです。すべての抗体が、すべての種で機能するわけではありません。

ステップ2：抗体を選択する

3 - 8種類の、目的の標的に対する検証済み抗体を選択します。SignalStarパネルでの使用が認められた抗体は、すべてのCST^®抗体と同様に、アプリケーションごとに独立に検証されています。そのため、これらは期待通りに機能することが保証されており、お客様は、信頼性と再現性の高い結果を取得できます。

ステップ3：パネルビルダーの結果を確認または編集する

パネルビルダーは、抗体を、様々な蛍光色素やイメージングラウンドと効率良く正確に組み合わせることができるため、お客様は、mIHCパネルの設計を自動化できます。パネルビルダーの結果を確認してそのまま利用する、または編集を選択して実験デザインのさらなる調整を行うことができます。

マルチプレックスIHCパネルを自分で設計する際の注意事項

 

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SignalStar™ Multiplex IHC抗体と蛍光色素を組み合わせる際の考慮事項

SignalStar Multiplex IHCパネルビルダーは、正確で効率的な抗体と蛍光色素の組み合わせやイメージングラウンドの設定といったパネルデザインを自動で行います。パネルビルダーの結果は、自由自在に編集可能です。パネルを編集する際は、以下の注意事項にご留意ください：

• タンパク質の存在量： 594と647のチャンネルが最も明るいため、存在量が最も少ない抗原と結合する抗体と組み合わせます。チャンネル750は、シグナル強度がより低いため、パネルビルダーでは一部の抗体とチャンネル750との組み合わせを制限しています。

• 自家蛍光： 組織内の存在量が少ないタンパク質の検出を想定している抗体は、自家蛍光の影響が少ないチャンネルに設定する必要があります。チャンネル488は、自家蛍光の影響が最も大きいため、存在量の少ないバイオマーカーは避けてください。

• イメージングラウンド： 大半の抗体は、イメージングラウンドに関係なく強く明確なシグナルを示しますが、これらのシグナル強度は、標的の発現レベルの低さや組織の質の悪さによる影響を受ける可能性があります。最良の結果を得るために、存在量が少ないタンパク質に対する抗体をイメージングラウンド1に設定し、存在量が多いマーカーなどの抗体をイメージングラウンド2に設定してください。パネルビルダーでは、一部の抗体を特定のイメージングラウンドで使用をすることを制限しています。

• イメージング機器： スペクトルの漏れ込みを回避ために、蛍光顕微鏡のスペクトル特性を考慮してください。落射蛍光顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡、および走査型蛍光顕微鏡は通常、以下のSignalStarチャンネルを区別できます。

  蛍光チャンネル	励起波長 (nm)	放射波長 (nm)	レーザー線	一般的なフィルターセット
  488	488	520	488	FITC
  594	590	618	561/594	Texas Red
  647	650	668	594/633	Cy®5
  750	752	776	633	Cy®7

  完成したパネルにDAPIの他に4種類の蛍光チャンネルが含まれる場合は、お手持ちの蛍光イメージング装置が、これらのパラメーターに基づいて各チャンネルを検出および区別分離できることを確認しておく必要があります。

• スペクトルの分離： SignalStar Multiplex IHCパネルに含まれる抗体や試薬、プロトコールは、スペクトルの重複が最小限になるように最適化されています。さらに、確実に各抗体の蛍光シグナルを分離するために、弊社は、上記の各チャンネルで個別に染色したスライドを用いたスペクトルライブラリーの作成を推奨しています。

  お手持ちのイメージング装置の特性が、これらの蛍光チャンネルの分離に適していない場合、スペクトルライブラリーを用いて蛍光シグナルをコンピューター上で分離できます。

ステップ4：注文を確認する

実験に必要なすべての抗体とバッファーキットが自動で買い物かごに追加されます。パネルビルダーで設計したパネルは、毎回買い物かごに追加されます。すでに買い物かごに入っているパネルを削除しないようにご注意ください。

SignalStar mIHCワークフロー

SignalStar mIHCアッセイは、FFPE組織内の最大8種類のバイオマーカーの同時標識が可能です。FFPE組織切片の脱パラフィン、再水和、抗原賦活化を行い (A)、希望のプレックスサイズ (3から最大8種類のオリゴ標識抗体) のすべての抗体を、1回の一次抗体インキュベーションステップの際に同時に添加します (B)。蛍光色素 (チャンネル：488、594、647、750) 標識済みの相補的なオリゴヌクレオチドを用いて構築したオリゴ - 蛍光色素のコンストラクトを抗体に結合させて、1回目のイメージングラウンドで最大4種類のオリゴ標識抗体のシグナルを増幅させます (C - D)。プレックスサイズが4より大きい場合は、1回目のオリゴヌクレオチドと蛍光色素を穏やかに除去し (E)、2回目のイメージングラウンドで、最大4種類の追加のオリゴ標識抗体のシグナルを増幅させます (F)。その後、お手持ちのソフトウェアまたはオープンソースのソフトウェアを用いてコンピューター上で2つの画像を結合し、8プレックスの完全な画像を作成します (G)。

サポートが必要ですか？

CSTは、研究にSignalStar Multiplex IHCを導入できるように最適化するための、専門家によるサポートを提供しています。

SignalStarに関するトラブルシューティング情報や技術的な質問に対する回答は、テクニカルサポートページをご覧ください。

Cell Signaling Technology, CST, and SignalStar are trademarks of Cell Signaling Technology, Inc. Cy is a registered trademark of GE Healthcare. All other trademarks are the property of their respective owners. Visit cellsignal.com/trademarks for more information.

U.S. Patent No. 10,781,477, foreign equivalents, and child patents deriving therefrom.