SignalStar^™を用いた空間プロファイリング

CSTが提供するSignalStar Multiplex IHCは、非常に柔軟かつ高度に検証された抗体パネルを提供する、空間生物学研究用の革新的な新しいツールです。

SignalStar技術は、高い感度と特異性をもって、FFPE組織内の複数のバイオマーカーを同時に増幅します。わずか2日間で、最大8種類の標的の正確かつ信頼性の高いデータを作成することができます。

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SignalStar Multiplex IHCとは？

SignalStar Multiplex IHCは、抗体やオリゴヌクレオチド、蛍光色素を用いて、標的の細胞内の存在や局在、機能、バイオマーカーとの共発現パターンを調査する技術です。SignalStarアッセイは、空間的な配置と組織の構造を保持しつつ、複数の標的の表現型および機能を検出できます。細胞が、どのようにして組織化し、疾患進行や治療への応答を制御する組織の微小環境に影響を与えるかを理解するためには、これらの知見が不可欠です。

マルチプレックスIHCを選ぶ理由

マルチプレックスIHC (mIHC) は、幅広い研究の解析に用いられる、汎用性のある強力なツールです。標的や細胞の天然状態の理解、取得するデータ量の最大化、細胞内での機能の理解、RNA情報が不十分な場合のタンパク質の検出などにおいて、マルチプレックスIHCは理想的なソリューションとなります。

天然状態の生物学と機能の理解

マルチプレックスIHCは、標的の元来の空間的な配置と細胞内での状態を維持したまま、1つの組織における複数のタンパク質や修飾バイオマーカーを同時に検出できるため、細胞や組織の基本的な機能に関する知見が得られます。

取得するデータ量を最大化

マルチプレックスIHCは、各サンプルから得られるデータ量を最大化することができるため、組織サンプルを追加する必要性が低減します。

翻訳後に関するより良い知見の取得

RNA解析では、遺伝子発現に関する情報を得ることはできても、リン酸化やグリコシル化、アセチル化といったタンパク質の翻訳後修飾を捉えることはできません。マルチプレックスIHCにより、複数のタンパク質修飾の同時検出が可能となり、基礎生物学をより包括的に理解できます。

SignalStar Multiplex IHCの手順

図の説明： SignalStarアッセイは、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織における最大8種類の標的の同時検出を可能にします。FFPE組織切片の脱パラフィン、再水和、抗原賦活化を行い (A)、ご希望のプレックスサイズ (3から最大8種類のオリゴ標識抗体) のすべての抗体を、1回の一次抗体インキュベーションステップの際に同時に添加します (B)。 1回目のイメージングラウンドでは、最大4種類のオリゴ標識抗体のシグナル (488、594、647、750 nm) を、抗体に大きなオリゴの分岐構造を構築することにより増幅させます (C-D)。プレックスサイズが4より大きい場合は、1回目のオリゴヌクレオチドと蛍光色素を穏やかに除去し (E)、2回目のイメージングラウンドで、最大4種類の追加のオリゴ標識抗体のシグナルを増幅させます (F)。その後、コンピューター上でお手持ちの、またはオープンソースのソフトウェアを用いて2つの画像を結合し、最大8プレックスの完全な画像を作成することができます (G)。

組織サンプルの調製

組織の採取と固定のプロセスは、サンプルの完全性と実験結果に直接影響するため大変重要です。組織の採取や保存、固定の方法は、サンプルや解析対象となる標的分子によって異なります。
ホルマリンなどのクロスリンク固定剤は、組織の構造的な完全性や仕組み保持するために、マルチプレックスIHCのサンプル調製によく利用されます。

抗原賦活化

固定剤は、組織サンプルの構造的完全性を保持する一方、抗体が認識するように設計されているエピトープがマスキングされることがあります。
固定によりマスキングされたエピトープを露出させる方法には、タンパク質分解酵素を用いた方法や、熱処理 (HIER：heat-induced epitope retrieval) などがあります。

一次抗体のインキュベーション

弊社の手動または自動プロトコールにおいて、あらゆる組み合わせで機能することが検証済みのますます拡大する抗体リストからお選びいただけます。プロトコールは完全に検証済みのため、パネルの再設計も簡単であり、すぐに使用可能です。
一度にすべての抗体を添加するため、抗体の染色サイクルを削減し、複数回のイメージング中に生じるエピトープの損失やマスキングを心配する必要がありません。
抗体の添加後に10%中性緩衝ホルマリン液で短時間固定することにより、抗体増幅やイメージング中も抗体をスライド上に維持することができます。

オリゴの増幅

蛍光シグナルを増幅することにより、自家蛍光が強い組織や幅広いダイナミックレンジを持つ標的の検出が可能になります。
1ラウンド目の4種類の各オリゴ標識抗体に特異的かつ相補的なオリゴヌクレオチドを添加し、その後蛍光標識済みのオリゴを追加することにより、シグナルを指数関数的に増幅できます。
スペクトル分離の必要性を低減するために、蛍光色素はスペクトルが明確に異なるものを使用します。
蛍光色素を含むオリゴを穏やかに除去することにより、抗体はそのままの状態で保持され、2ラウンド目の増幅とイメージングを行うことができます。
抗体はおおよそすべての蛍光色素と組み合わせることができ、すぐに実験を開始できます。

SignalStar Multiplex IHCの利点

わずか2日間でデータを作成

他のマルチプレックス技術では、最適化と検証に数週間から数か月を要することがあります。SignalStar技術は、最適化されたready-to-goパネルにより、これらにかかる時間を省きます。FFPE組織ですぐに使用可能なIHC検証済み抗体のリストから、標的をお選びいただけます。

必要なシグナルが初回から得られる感度の高いアッセイを用いて、躊躇うことなく限られた貴重なFFPE組織サンプルを解析してください。SignalStarアッセイは、1つの組織で最大8種類のタンパク質の蛍光シグナルを増幅できます。

図の説明： パラフィン包埋ヒト胃腺がん組織を、Pan-Keratin (C11) & CO-0003-488 SignalStar Oligo-Antibody Pair #63566 (赤)、PD-L1 (E1L3N) & CO-0005-488 SignalStar Oligo-Antibody Pair #85646 (緑)、PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) & CO-0008-594 SignalStar Oligo-Antibody Pair #35347 (黄)、Granzyme B (D6E9W) & CO-0009-594 SignalStar Oligo-Antibody Pair #15194 (オレンジ)、TIGIT (E5Y1W) & CO-0002-647 SignalStar Oligo-Antibody Pair #18288 (シアン)、CD20 (E7B7T) & CO-0011-647 SignalStar Oligo-Antibody Pair #36775 (ピンク)、CD3ε (D7A6E) & CO-0001-750 SignalStar Oligo-Antibody Pair #51754 (マゼンタ)、CD8α (D8A8Y) & CO-0004-750 SignalStar Oligo-Antibody Pair #62750 (白)、ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI #8961 (青) を用いてSignalStarマルチプレックス免疫組織化学染色し解析しました。各マーカーの個別の染色像および結合した8プレックスの染色像を示しています。すべての蛍光色素に対し、記載した疑似カラーを割り当てています。染色は、Leica Biosystems社のBOND RX自動染色装置で行いました。

パネルの再設計が簡単

多くのソリューションは、変化する研究ニーズに対する柔軟性がありません。SignalStarパネルは、ニーズの変化に応じて簡単に標的を変更してパネルを再設計できる柔軟性を備えています。プロトコールは検証済みであり、すぐに使えるように最適化されています。

SignalStar技術は、SignalStar Multiplex IHCパネルビルダーで設計したパネルに左右されることなく、一貫性のある染色を行うことができます。また、パネルはすぐに使用可能です。さらに、抗体の組み合わせや実験方法、イメージング装置が異なっていても、各プロトコールは再現性を示します。

図の説明：組織マイクロアレイ内のパラフィン包埋ヒト甲状腺髄様がん組織を、SignalStarマルチプレックス免疫組織化学染色し解析しました。パネル1：PD-L1 (E1L3N^®) & CO-0005-647 SignalStar Oligo-Antibody Pair #52085 (黄)、PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) & CO-0008-594 SignalStar Oligo-Antibody Pair #35347 (非表示)、CD68 (D4B9C) & CO-0007-488 SignalStar Oligo-Antibody Pair #73071 (非表示)、CD3ε (D7A6E) & CO-0001-750 SignalStar Oligo-Antibody Pair#51754 (非表示) で染色しました。パネル2：PD-L1 (E1L3N) & CO-0005-647 SignalStar Oligo-Antibody Pair #52085 (黄)、PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) & CO-0008-594 SignalStar Oligo-Antibody Pair #35347 (非表示)、CD68 (D4B9C) & CO-0007-488 SignalStar Oligo-Antibody Pair #73071 (非表示)、CD3ε (D7A6E) & CO-0001-750 SignalStar Oligo-Antibody Pair #62750 (非表示) で染色しました。パネル3：PD-L1 (E1L3N) & C0-0005-647 SignalStar Oligo-Antibody Pair #52085 (黄)、PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) & C0-0008-594 SignalStar Oligo-Antibody Pair #35347 (非表示)、Ki-67 (8D5) & C0-0014-488 SignalStar Oligo-Antibody Pair #89034 (非表示)、CD8α (D8A8Y) & C0-0004-750 SignalStar Oligo-Antibody Pair #62750 (非表示) で染色しました。すべての蛍光色素に対し、記載した疑似カラーを割り当てています。染色は、BOND RX自動染色装置で行いました。連続切片の、同じ領域におけるPD-L1陽性細胞の割合を、3種類の異なるSignalStar 4プレックスパネルを用いて定量し、PD-L1 (E1L3N) & CO-0005-647 SignalStar Oligo Antibody Pair #52085 (黄) を用いたSignalStarシングルプレックス染色およびPD-L1 (E1L3N) XP^® Rabbit mAb #13684を用いた発色染色と比較しました。

シグナルを増幅

他の多くのソリューションとは異なり、SignalStarパネルはシグナルの増幅機能を備えています。SignalStar技術は、標的のシグナルを増幅するため、発現レベルが低くても簡単に検出できます。そのため、発現レベルの低い標的を検出でき、これまで以上に多くの情報が得られます。

図の説明： パラフィン包埋Oヒト扁桃組織を、PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) & CO-008-647 SignalStar Oligo-Antibody Pair #56837 (赤) およびProLong Gold Antifade Reagent with DAPI #8961 (青) を用いてSignalStarマルチプレックス免疫組織化学染色して解析し、anti-rabbit IgG (H+L)、F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414、PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) XP^® Rabbit mAb (Alexa Fluor^® 647 Conjugate)、PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J) XP^® Rabbit mAb #86163を用いて検出した結果と比較しました。すべての蛍光色素に対し、記載した疑似カラーを割り当てています。染色は、BOND RX自動染色装置で行いました。PD-1陽性細胞の平均蛍光強度は、SignalStarアッセイ用の連続切片における同じ領域内で定量し、間接および直接発色法と比較しました。

いつでも再現可能

CSTは、弊社抗体をSignalStarアッセイで検証しており、期待通りに機能することを保証します。すべてのSignalStar抗体は、発色法のゴールドスタンダードで検証済みであり、異なる同様のサンプル間でも一貫した再現性を示します。

弊社の検証プロセスでは、まずIHC-Pの検証を行い、その後にSignalStar Multiplex IHC用の抗体検証を行います。

図の説明： パラフィン包埋ヒト大腸腺がん組織を、Pan-Keratin (C11) & CO-0003-488 SignalStar Oligo-Antibody Pair #63566 (緑)、PD-L1 (E1L3N^®) & CO-0005-594 SignalStar Oligo-Antibody Pair #28249 (黄)、CD20 (E7B7T) & CO-0011-647 SignalStar Oligo-Antibody Pair #36775 (赤)、CD8α (D8A8Y) & CO-0004-750 SignalStar Oligo-Antibody Pair #62750 (シアン) を用いてSignalStarマルチプレックス免疫組織化学染色し解析しました。各マーカーの個別の染色像および結合した4プレックスの染色像を示しています。すべての蛍光色素に対し、記載した疑似カラーを割り当てています。染色は、BOND RX自動染色装置で行いました。連続切片を用いたSignalStarアッセイ (n=2) から、同じ領域における陽性細胞率を定量し、発色法と比較しました。

お手持ちの装置を活用

SignalStarパネルは、明確な発光ピークを持つ安定した蛍光シグナルを示すため、お手持ちのイメージング装置との互換性があります。

3から8プレックスのアッセイを行うために、各チャンネル (488、594、647、750 nm) を持つ顕微鏡を用いてスライドをイメージングします。プロトコールの実行にかかる時間は6時間であり、4プレックスは1日で、8プレックスは2日間で染色およびイメージングを行うことができます。自動プロトコールの場合は、一晩で染色することができるため、作業時間を大きく削減できます。

信頼性の高い実験データを取得

SignalStarパネルに用いられる個々の抗体は、使用を予定しているアプリケーションごとに独立して検証されており、信頼性と再現性のある結果を初回ならびに毎回提供するすべてのCST^®抗体と同様に、期待通りに機能することが保証されています。また、市場で最も引用された抗体を利用することができます。

抗体の染色サイクルを削減

エピトープの損失やマスキングを心配することなく、一度にすべての抗体を添加できます。

実験計画を迅速化

弊社が提供する、オンラインの使いやすいSignalStar Multiplex IHCパネルビルダーが設計作業を行うため、お客様が作業をする必要はありません。

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