Cat. # | Size | Qty. | Price | Inventory |
---|---|---|---|---|
9733T | 20 µl |
|
||
9733S | 100 µl |
|
REACTIVITY | H M R Mk |
SENSITIVITY | Endogenous |
MW (kDa) | 17 |
Source/Isotype | Rabbit IgG |
Product Information
For optimal ChIP and ChIP-seq results, use 10 μl of antibody and 10 μg of chromatin (approximately 4 x 106 cells) per IP. This antibody has been validated using SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kits.
The CUT&RUN dilution was determined using CUT&RUN Assay Kit #86652.
The CUT&Tag dilution was determined using CUT&Tag Assay Kit #77552.
Application | Dilution |
---|---|
Western Blotting | 1:1000 |
IHC Leica Bond | 1:200 - 1:800 |
Immunohistochemistry (Paraffin) | 1:100 - 1:400 |
Immunofluorescence (Immunocytochemistry) | 1:800 - 1:3200 |
Flow Cytometry (Fixed/Permeabilized) | 1:100 - 1:400 |
Chromatin IP | 1:50 |
Chromatin IP-seq | 1:50 |
CUT&RUN | 1:50 |
CUT&Tag | 1:50 |
For western blots, incubate membrane with diluted primary antibody in 5% w/v BSA, 1X TBS, 0.1% Tween® 20 at 4°C with gentle shaking, overnight.
NOTE: Please refer to primary antibody product webpage for recommended antibody dilution.
From sample preparation to detection, the reagents you need for your Western Blot are now in one convenient kit: #12957 Western Blotting Application Solutions Kit
NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.
Load 20 µl onto SDS-PAGE gel (10 cm x 10 cm).
NOTE: Loading of prestained molecular weight markers (#59329, 10 µl/lane) to verify electrotransfer and biotinylated protein ladder (#7727, 10 µl/lane) to determine molecular weights are recommended.
NOTE: Volumes are for 10 cm x 10 cm (100 cm2) of membrane; for different sized membranes, adjust volumes accordingly.
* Avoid repeated exposure to skin.
posted June 2005
revised June 2020
Protocol Id: 10
NOTE: Please see product datasheet or product webpage for appropriate antibody dilution^.
Step | Reagents | Time/Temperature | |
---|---|---|---|
1 | Dewax | BOND™ Dewax Solution, 100% Alcohol, BOND™ Wash Solution | Pre-programmed Leica® BOND™ |
2 | Antigen Retrieval | BOND™ Epitope Retrieval ER2 Solution | 20 min., 100˚C | Protocol: HIER 20 min with ER2 |
3 | Peroxide Block | Refine Detection Kit Peroxide Block* | 5 min. |
WASH | BOND™ Wash Solution | 3x 0:00 min. | |
4 | Protein Block (optional) | #5425 NGS or #15019 Animal-Free Blocking Solution | 20 min. |
5 | Primary Antibody^ | Dilute in #8112 SignalStain® Antibody Diluent | 30 min. |
WASH | BOND™ Wash Solution | 3x 2:00 min. | |
NA | Post Primary Mouse Linker | Refine Detection Kit Post Primary* | Not Applied |
6 | Secondary Detection | Refine Detection Kit Polymer* | 10 min. |
WASH | BOND™ Wash Solution/Deionized Water | Custom (see below) | |
7a | Visualization | Refine Detection Kit Mixed DAB Refine* | 0:00 min. |
7b | Visualization | Refine Detection Kit Mixed DAB Refine* | 10 min. |
WASH | Deionized Water | 3x 0:00 min. | |
8 | Counterstain | Refine Detection Kit Hematoxylin* | 5 min. |
WASH | Deionized Water | 0:00 min. | |
WASH | BOND™ Wash Solution | 0:00 min. | |
WASH | Deionized Water | 0:00 min. | |
9 | Dehydration (Offline): | ||
Incubate sections in 95% ethanol two times for 10 seconds each. | |||
Repeat in 100% ethanol, incubating sections two times for 10 seconds each. | |||
Repeat in xylene, incubating sections two times for 10 seconds each. | |||
10 | Mount sections with coverslips and #84583 SignalStain® Mounting Medium | ||
Optional Custom wash: | BOND™ Wash Solution | 2:00 | |
BOND™ Wash Solution | Dispenser Type: OPEN 0:00 | ||
BOND™ Wash Solution | 2:00 | ||
BOND™ Wash Solution | Dispenser Type: OPEN 0:00 | ||
BOND™ Wash Solution | 0:00 | ||
Deionized Water | 0:00 |
*Reagent included in BOND™ Polymer Refine Detection Kit (Catalog No: DS9800)
LEICA® is a registered trademark of Leica Microsystems IR GmbH.
BOND™ is a trademark of Leica Biosystems Melbourne Pty. Ltd. No affiliation or sponsorship between CST and Leica Microsystems IR GmbH or Leica Biosystems Melbourne Pty. Ltd is implied.
posted August 2018
revised September 2018
Protocol Id: 1444
NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.
NOTE: Do not allow slides to dry at any time during this procedure.
For Citrate: Heat slides in a microwave submersed in 1X citrate unmasking solution until boiling is initiated; follow with 10 min at a sub-boiling temperature (95°-98°C). Cool slides on bench top for 30 min.
RECOMMENDED DETECTION REAGENTS |
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 | SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653 |
---|---|---|
COMPATIBLE CHROMOGEN |
SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 | SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713 |
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632 | SignalStain® Ultra Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit #12824 | |
SignalStain® Deep Black Peroxidase Substrate Kit #72986 | ||
SignalStain® Radiant Yellow Peroxidase Substrate Kit #69644 |
NOTE: Use of detection reagents other than those specified in this protocol may require further optimization of the primary antibody to account for the different sensitivities of the detection reagents.
posted February 2010
revised June 2020
Protocol Id: 283
Achieve higher quality immunofluorescent images using the efficient and cost-effective, pre-made reagents in our #12727 Immunofluorescence Application Solutions Kit
NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.
Recommended Fluorochrome-conjugated Anti-Rabbit secondary antibodies:
NOTE: Cells should be grown, treated, fixed and stained directly in multi-well plates, chamber slides or on coverslips.
Aspirate liquid, then cover cells to a depth of 2–3 mm with 4% formaldehyde diluted in 1X PBS.
NOTE: Formaldehyde is toxic, use only in a fume hood.
NOTE: All subsequent incubations should be carried out at room temperature unless otherwise noted in a humid light-tight box or covered dish/plate to prevent drying and fluorochrome fading.
posted November 2006
revised November 2013
Protocol Id: 24
All reagents required for this protocol may be efficiently purchased together in our Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593, or individually using the catalog numbers listed below.
NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.
NOTE: When including fluorescent cellular dyes in your experiment (including viability dyes, DNA dyes, etc.), please refer to the dye product page for the recommended protocol. Visit www.cellsignal.com for a full listing of cellular dyes validated for use in flow cytometry.
NOTE: Adherent cells or tissue should be dissociated and in single-cell suspension prior to fixation.
NOTE: Optimal centrifugation conditions will vary depending upon cell type and reagent volume. Generally, 150-300g for 1-5 minutes will be sufficient to pellet the cells.
NOTE: If using whole blood, lyse red blood cells and wash by centrifugation prior to fixation.
NOTE: Antibodies targeting CD markers or other extracellular proteins may be added prior to fixation if the epitope is disrupted by formaldehyde and/or methanol. The antibodies will remain bound to the target of interest during the fixation and permeabilization process. However, note that some fluorophores (including PE and APC) are damaged by methanol and thus should not be added prior to permeabilization. Conduct a small-scale experiment if you are unsure.
NOTE: Count cells using a hemocytometer or alternative method.
posted July 2009
revised June 2020
Protocol Id: 404
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005の専用プロトコールです。
キットに含まれている試薬:
キットに含まれない試薬:
! | この ! マークは、免疫沈降 (IP prep) のサンプル数に応じて量の変更する重要ステップであることを意味します。免疫沈降1回分 (1 IP prep) は、4 x 106個の組織培養細胞、または25 mgの破砕した組織に相当します。 |
!! | この !! マークは、操作を進める前にバッファーを希釈する重要なステップであることを意味します。 |
SAFE STOP | これは、実験操作を中断する必要がある場合に、プロトコールを安全に中断できるポイントを示します。 |
組織を採取する際、脂肪や壊死組織などの不要な部分を取り除きます。組織サンプルはすぐに使用して直ちにクロスリンクするか、次に使用するまでドライアイスで凍結して-80℃で保存してください。最適なクロマチン収量とChIP結果を得るため、各免疫沈降あたり25 mgの組織を使用します。クロマチン収量は組織の種類により異なるため、一部の組織では各免疫沈降あたり25 mgを超える量が必要となります。組織ごとに予測されるクロマチン収量については、Appendix Aを参照してください。クロマチンの断片化および濃度の解析 (セクションIV) のためにクロマチンサンプルを1本余分に用意してください。必要に応じて5本のクロマチンサンプルを追加で用意し、クロマチン断片化の最適化 (Appendix B) で使用します。
(!) すべてのバッファーの量は、免疫沈降 (IP prep) のサンプル数に応じて比例的に増やす必要があります。
最適なChIPの結果を得るため、各免疫沈降に対し約4 x 106個の細胞を使用します。ポジティブコントロールとネガティブコントロールを含めると、少なくとも12 x 106個の細胞が必要です。HeLa細胞の場合、免疫沈降1回分は増殖培地20 mLで90%コンフルエントに培養した15 cmディッシュの半分量に相当します。クロマチンサンプルを1本余分に用意し、クロマチンの断片化および濃度についての解析に使用します (セクションIV)。さらに、細胞種ごとに培養ディッシュを1枚余分に用意し、血球計算盤またはセルカウンターを用いて細胞数を計測することを推奨します。
(!) 全てのバッファーの量は、使用する15 cmの組織培養ディッシュ (または20 mLの浮遊細胞) の枚数に応じて、比例的に増やす必要があります。
(!) すべてのバッファーの量は、免疫沈降 (IP prep) のサンプル数に応じて比例的に増やす必要があります。
(!!) 重要:溶解したら、1M DTTは-20℃で保存してください。
注意:最適なChIPの結果を得るためには、クロマチンのサイズと濃度を適切にすることが非常に重要です。クロマチンを断片化しすぎると、定量PCRのシグナルが消失する可能性があります。一方で、クロマチンの断片化が不十分な場合、バックグラウンドシグナルが上昇し分解能が低下します。また、免疫沈降に用いるクロマチン量が少なすぎると、定量PCRのシグナルが低下する原因になります。クロマチンの断片化を最適化するためのプロトコルは、Appendix Bに記載されています。
最適なChIPの結果を得るため、免疫沈降1回あたり約5-10 μgの断片化されたクロスリンククロマチン (セクションIVに記載) を使用してください。これは、25 mgの破砕した組織あるいは4 x 106個の培養細胞から調製された免疫沈降サンプル100 μL分に概ね相当します。一般的には、抗体を加える前にクロマチンサンプル100 μLを1X ChIP Buffer 400 μLで希釈しますが、免疫沈降1回あたり100 μL以上必要な場合は下記のようにクロマチンサンプルを希釈する必要はありません。希釈しない場合も、クロマチンサンプルに直接抗体を加えることでクロマチン複合体の免疫沈降ができます。
(!) すべてのバッファーの量は、免疫沈降の回数に応じて比例的に増やす必要があります。
注意:Cell Signaling Technologyのほとんどの抗体は、免疫沈降1回あたり1-2 µgを使用することで適切にワークします。濃度の異なる複数の抗体がある場合は、最も高い抗体濃度にネガティブコントロールNormal Rabbit IgG #2729の濃度を合わせて使用することをお勧めします。
(!) すべてのバッファーの量は、免疫沈降の回数に応じて比例的に増やす必要があります。
プライマーの長さ: | 24塩基 |
Tm: | 60°C |
GC: | 50% |
アンプリコンのサイズ: | 150-200 bp (通常のPCR) |
80-160 bp (定量的リアルタイムPCR) |
試薬 | PCR反応1回分の分量 (18 μL) |
---|---|
Nuclease-free H2O | 12.5 µL |
10X PCR Buffer | 2.0 µL |
4 mM dNTP Mix | 1.0 µL |
5 µM RPL30 プライマー | 2.0 µL |
Taq DNA Polymerase | 0.5 µL |
a. | 初期変性 | 95℃ | 5分間 |
b. | 変性 | 95℃ | 30 秒間 |
c. | アニーリング | 62℃ | 30 秒間 |
d. | 伸長反応 | 72℃ | 30 秒間 |
e. | ステップb-dを繰り返し、計34サイクル反応させてください。 | ||
f. | 最終伸長反応 | 72℃ | 5分間 |
試薬 | PCR反応1回分の分量 (18 μL) |
---|---|
Nuclease-free H2O | 6 µL |
5 µM RPL30 プライマー | 2 µL |
SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 | 10 µL |
a. | 初期変性 | 95℃ 3分間 |
b. | 変性 | 95℃ 15秒間 |
c. | アニーリングおよび伸長: | 60℃ 60秒間 |
d. | ステップb - cの繰り返し (合計40サイクル) |
リアルタイムPCR装置に付属のソフトウェアを使用して、定量結果を解析してください。代替法として、Percent Input法により下記の公式を用いて、免疫沈降の効率を算出することもできます。この方法では、各免疫沈降で回収されたシグナルを、インプットクロマチン総量の割合 (%) で示します。
Percent Input = 2% x 2(C[T] 2%Input Sample - C[T] IP Sample)
C[T] = CT= PCR反応の閾値となるサイクル
本キットを用いて調製したDNAサンプルは、直接ChIP-seqに使用できます。NG-シークエンスDNAライブラリーの構築は、採用予定のシーケンスプラットフォームと互換性のあるDNAライブラリー調製プロトコールまたはキットを使用して行ってください。Illumina®プラットフォームでのシーケンシングの場合、DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795と、関連するインデックスプライマーMultiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580もしくは、Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538の使用を推奨します。
推奨事項:
組織サンプルからクロスリンククロマチンを調製する場合、組織の種類によってクロマチン収量が大きく異なります。右の表には、4 x 106個のHeLa細胞の場合と比較しながら、25 mgの組織から調製した場合に予想されるクロマチン収量と、予想されるDNA濃度を示しています。これらは、プロトコールのセクションIVに記載した方法で決定しています。各組織において、Medimachine (BD Biosciences) またはDounce Homogenizerのどちらを用いてホモジナイズした場合もクロマチン収量はほぼ同じでした。ただし、多くの場合、Medimachineを用いて破砕した組織から得たクロマチンは、Dounce Homogenizerを用いた場合よりも免疫沈降効率が高くなりました。脳組織サンプルに関しては、Medimachineでは単細胞懸濁液になるまで十分に破砕することができないため、Dounce Homogenizerを使用してください。最適なChIPの結果を得るためには、免疫沈降1回あたり5-10 µgの断片化したクロスリンククロマチンの使用をお勧めします。組織によっては、免疫沈降1回に必要な組織量が25 mgを超えることがあります。
組織/細胞 | 総クロマチン収量 | 予想されるDNA濃度 |
---|---|---|
脾臓 | 25 mgの組織に対し20-30 µg | 200 - 300 µg/mL |
肝臓 | 25 mgの組織に対し10-15 µg | 100 - 150 µg/mL |
腎臓 | 25 mgの組織に対し8-10 µg | 80 - 100 µg/mL |
脳 | 25 mgの組織に対し2-5 µg | 20 - 50 µg/mL |
心臓 | 25 mgの組織に対し2-5 µg | 20 - 50 µg/mL |
HeLa | 4 x 106個の細胞に対し10-15 µg | 100 - 150 µg/mL |
クロスリンクしたクロマチンDNAを150-900 bpの長さに断片化する場合の最適条件は、断片化に用いる組織量または細胞数に対するMicrococcal Nucleaseの比率に大きく依存します。特定の組織または細胞タイプで、クロマチンの断片化の至適条件を決定するプロトコールを以下に示します。
問題 | 考えられる原因 | 推奨される対処法 |
---|---|---|
1. 断片化されたクロマチンの濃度が低すぎる。 | 細胞数が不十分、あるいは断片化後の細胞核の破砕が不完全。 | クロマチンサンプルのDNA濃度が50 μg/mLに近い場合は、1回の免疫沈降あたり少なくとも5 μgとなるようにクロマチン調製液を追加して、プロトコールに従って実験を続けてください。 クロスリンクの前に、カウント用に別に用意したディッシュで細胞数を計測し、正確な細胞数を確認してください。さらに、顕微鏡下でソニケーション前後の細胞核を観察し、核の完全な破砕を確認してください。 |
2. クロマチンの断片化が不十分で、断片が大きすぎる (900 bpを超える)。 | 細胞のクロスリンクが過剰。10分間以上クロスリンクを行うと、クロマチンの断片化を阻害する可能性がある。 細胞数が多すぎる、またはMicrococcal Nuclease量が足りない。 | ホルムアルデヒド濃度を一定にして、時間経過に伴う変化を確認してください。クロスリンク時間を10分以下に短縮してください。 クロスリンクの前に別に用意したプレートの細胞数を計測し、Appendix Bを参照してクロマチンの断片化条件を最適化します。 |
3. クロマチンが過剰に断片化され、DNA断片のサイズが小さすぎる (150 bpのモノヌクレオソーム1個分の断片ばかりが検出される)。ヌクレオソーム1個分のDNAの長さになるまでクロマチンを完全に断片化すると、特に長さが150 bp以上のアンプリコンの場合、PCRでシグナルが減弱する可能性がある。 | クロマチン断片化に加えた細胞数が不十分、またはMicrococcal Nuclease量が多すぎる。 | クロスリンクの前に別に用意したプレートの細胞数を計測し、Appendix Bを参照してクロマチンの断片化条件を最適化します。 |
4. インプットDNAのPCR反応で産物が得られない、または得られる量が非常に少ない。 | PCR反応に使用したDNA量が十分でない、またはPCR条件が最適でない。 PCRの増幅領域が、ヌクレオソームフリー領域に及んでいる。 IPに加えたクロマチンが十分でない、またはクロマチンの断片化が過剰。 | PCR反応により多くのDNAを使用するか、サイクル数を増加させてください。 クロスリンク後に断片化したクロマチンから精製したDNAを用いて、プライマーセットに対する最適なPCR条件を検討してください。アンプリコンの長さが150 bp以下になるように、別のプライマーセットを設計してください (セクションIIIのプライマー設計に関する推奨事項を参照してください)。 最適なChIP結果を得るために、免疫沈降1回あたりクロマチン5-10 μgを加えてください。上記1、3の対応策も参照してください。 |
5. ポジティブコントロールであるHistone H3抗体の免疫沈降サンプルとRPL30プライマーを用いたPCR反応で増幅が起こらない。 | 免疫沈降に加えたクロマチンまたは抗体が十分でない、または免疫沈降のインキュベーション時間が短すぎる。 Protein G Beadsからのクロマチンの溶出が不十分である。 | 各免疫沈降反応にクロマチン5-10 μgと抗体10 μLを加えたことを確認して一晩インキュベートし、Protein G Beadsを加えてさらに2時間インキュベートしてください Protein G Beadsからのクロマチンの溶出には65℃が最適です。頻繁に撹拌してBeadsの懸濁状態を保ってください。 |
6. ネガティブコントロールのRabbit IgGの免疫沈降産物と、ポジティブコントロールのHistone H3抗体の免疫沈降産物で、PCRでの増幅が同程度になる。 | 免疫沈降に使用したクロマチン量が過剰、または十分でない。あるいは、免疫沈降に抗体を加えすぎている。 PCR反応に加えたDNAが多すぎる、またはサイクル数が多すぎる。 | 各免疫沈降反応に対して加える量は、クロマチン15 μg、Histone H3 antibody 10 μLを上限としてください。Normal rabbit IgG量を一回のIPあたり1 μLまで減らしてください。 PCR反応に加えるDNAを減らすか、PCRのサイクル数を減らしてください。PCRの線形増幅領域内でPCR産物を解析することが非常に重要です。そうしなければ、増幅前のDNA量の差が正確に測定できません。 |
7. 解析したいターゲットの抗体の免疫沈降産物で、PCR反応による増幅が起こらない。 | PCR反応に加えたDNA量が十分でない。 免疫沈降に使用した抗体量が十分でない。 免疫沈降ではワークしない抗体である。 | PCR反応により多くのDNAを使用するか、サイクル数を増加させてください。 通常は抗体1-5 μgを免疫沈降に加えます。しかし、実際に必要な量は抗体によって大きく異なります。 免疫沈降反応液に加える抗体の量を増やしてください。別の抗体を検討してください。 |
更新:2011年12月
改訂日:2022年4月
Protocol Id: 82
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005の専用プロトコールです。
キットに含まれている試薬:
キットに含まれない試薬:
組織を採取する際、脂肪や壊死組織などの不要な部分を取り除きます。組織を処理し直ちにクロスリンクするか、使用するまでドライアイスで凍結して保存してください。最適なクロマチン収量とChIP結果を得るため、各免疫沈降あたり25 mgの組織を使用します。クロマチン収量は組織の種類により異なるため、一部の組織では各免疫沈降あたり25 mgを超える量が必要となります。組織ごとに予測されるクロマチン収量については、Appendix Aを参照してください。クロマチンの断片化および濃度の解析 (セクションIV) のためにクロマチンサンプルを1本余分に用意してください。
最適なChIP結果を得るためには、各免疫沈降につき4x106細胞を使用してください。HeLa細胞では、増殖培地20 mLで90%コンフルエントに培養した15 cmディッシュの半分量に相当します。クロマチンサンプルを1本余分に用意し、クロマチンの断片化および濃度についての解析に使用します (セクションIV)。血球計算盤を使用した細胞数測定に使用するために、培養ディッシュを余分に1枚用意してください。
免疫沈降サンプル 1回分は、25 mgの破砕した組織または4 x 106の培養細胞に相当します。
1 M DTT (DTT #7016 192.8 mg + 精製水 (dH2O) 1.12 mL) を調製します。DTTの結晶が完全に溶解されていることを確認してください。
重要:溶解したら、1M DTTは-20℃で保存してください。
注意:最適なChIPの結果を得るためには、クロマチンのサイズと濃度を適切にすることが非常に重要です。クロマチンを断片化しすぎると、定量PCRのシグナルが消失する可能性があります。一方で、クロマチンの断片化が不十分な場合、バックグラウンドシグナルが上昇し分解能が低下します。また、免疫沈降に用いるクロマチン量が少なすぎると、定量PCRのシグナルが低下する原因になります。クロマチンの断片化を最適化するためのプロトコルは、Appendix Bに記載されています。
最適なChIPの結果を得るため、免疫沈降1回あたり約5-10 μgの断片化されたクロスリンククロマチン (セクションIVに記載) を使用してください。これは、25 mgの破砕した組織あるいは4 x 106個の培養細胞から調製された免疫沈降サンプル100 μL分に概ね相当します。一般的には、抗体を加える前にクロマチンサンプル100 μLを1X ChIP Buffer 400 μLで希釈しますが、免疫沈降1回あたり100 μL以上必要な場合は下記のようにクロマチンサンプルを希釈する必要はありません。希釈しない場合も、クロマチンサンプルに直接抗体を加えることでクロマチン複合体の免疫沈降ができます。
注意:Cell Signaling Technologyのほとんどの抗体は、免疫沈降1回あたり1-2 µgを使用することで適切にワークします。濃度の異なる複数の抗体がある場合は、最も高い抗体濃度にネガティブコントロールNormal Rabbit IgG #2729の濃度を合わせて使用することをお勧めします。
プライマーの長さ: | 24塩基 |
Tm: | 60°C |
GC: | 50% |
アンプリコンのサイズ: | 150-200 bp (通常のPCR) |
80-160 bp (定量的リアルタイムPCR) |
試薬 | PCR反応1回分の分量 (18 μL) |
---|---|
Nuclease-free H2O | 12.5 µL |
10X PCR Buffer | 2.0 µL |
4 mM dNTP Mix | 1.0 µL |
5 µM RPL30 プライマー | 2.0 µL |
Taq DNA Polymerase | 0.5 µL |
a. | 初期変性 | 95℃ | 5分間 |
b. | 変性 | 95℃ | 30 秒間 |
c. | アニーリング | 62℃ | 30 秒間 |
d. | 伸長反応 | 72℃ | 30 秒間 |
e. | ステップb-dを繰り返し、計34サイクル反応させてください。 | ||
f. | 最終伸長反応 | 72℃ | 5分間 |
試薬 | PCR反応1回分の分量 (18 μL) |
---|---|
Nuclease-free H2O | 6 µL |
5 µM RPL30 プライマー | 2 µL |
SYBR-Green Reaction Mix | 10 µL |
a. | 初期変性 | 95℃ 3分間 |
b. | 変性 | 95℃ 15秒間 |
c. | アニーリングおよび伸長: | 60℃ 60秒間 |
d. | ステップb - cの繰り返し (合計40サイクル) |
リアルタイムPCR装置に付属のソフトウェアを使用して、定量結果を解析してください。代替法として、Percent Input法により下記の公式を用いて、免疫沈降の効率を算出することもできます。この方法では、各免疫沈降で回収されたシグナルを、インプットクロマチン総量の割合 (%) で示します。
Percent Input = 2% x 2(C[T] 2%Input Sample - C[T] IP Sample)
C[T] = CT= PCR反応の閾値となるサイクル
本キットを用いて調製したDNAサンプルは、直接ChIP-seqに使用できます。NG-シークエンスDNAライブラリーの構築は、採用予定のシーケンスプラットフォームと互換性のあるDNAライブラリー調製プロトコールまたはキットを使用して行ってください。Illumina®プラットフォームでのシーケンシングの場合、DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795と、関連するインデックスプライマーMultiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580もしくは、Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538の使用を推奨します。
推奨事項:
組織サンプルからクロスリンククロマチンを調製する場合、組織の種類によってクロマチン収量が大きく異なります。右の表には、4 x 106個のHeLa細胞の場合と比較しながら、25 mgの組織から調製した場合に予想されるクロマチン収量と、予想されるDNA濃度を示しています。これらは、プロトコールのセクションIVに記載した方法で決定しています。各組織において、Medimachine (BD Biosciences) またはDounce Homogenizerのどちらを用いてホモジナイズした場合もクロマチン収量はほぼ同じでした。ただし、多くの場合、Medimachineを用いて破砕した組織から得たクロマチンは、Dounce Homogenizerを用いた場合よりも免疫沈降効率が高くなりました。脳組織サンプルに関しては、Medimachineでは単細胞懸濁液になるまで十分に破砕することができないため、Dounce Homogenizerを使用してください。最適なChIPの結果を得るためには、免疫沈降1回あたり5-10 µgの断片化したクロスリンククロマチンの使用をお勧めします。組織によっては、免疫沈降1回に必要な組織量が25 mgを超えることがあります。
組織/細胞 | 総クロマチン収量 | 予想されるDNA濃度 |
---|---|---|
脾臓 | 25 mgの組織に対し20-30 µg | 200 - 300 µg/mL |
肝臓 | 25 mgの組織に対し10-15 µg | 100 - 150 µg/mL |
腎臓 | 25 mgの組織に対し8-10 µg | 80 - 100 µg/mL |
脳 | 25 mgの組織に対し2-5 µg | 20 - 50 µg/mL |
心臓 | 25 mgの組織に対し2-5 µg | 20 - 50 µg/mL |
HeLa | 4 x 106個の細胞に対し10-15 µg | 100 - 150 µg/mL |
クロスリンクしたクロマチンDNAを150-900 bpの長さに断片化する場合の最適条件は、断片化に用いる組織量または細胞数に対するMicrococcal Nucleaseの比率に大きく依存します。特定の組織または細胞タイプで、クロマチンの断片化の至適条件を決定するプロトコールを以下に示します。
問題 | 考えられる原因 | 推奨される対処法 |
---|---|---|
1. 断片化されたクロマチンの濃度が低すぎる。 | 細胞数が不十分、あるいは断片化後の細胞核の破砕が不完全。 | クロマチンサンプルのDNA濃度が50 μg/mLに近い場合は、1回の免疫沈降あたり少なくとも5 μgとなるようにクロマチン調製液を追加して、プロトコールに従って実験を続けてください。 クロスリンクの前に、カウント用に別に用意したディッシュで細胞数を計測し、正確な細胞数を確認してください。さらに、顕微鏡下でソニケーション前後の細胞核を観察し、核の完全な破砕を確認してください。 |
2. クロマチンの断片化が不十分で、断片が大きすぎる (900 bpを超える)。 | 細胞のクロスリンクが過剰。10分間以上クロスリンクを行うと、クロマチンの断片化を阻害する可能性がある。 細胞数が多すぎる、またはMicrococcal Nuclease量が足りない。 | ホルムアルデヒド濃度を一定にして、時間経過に伴う変化を確認してください。クロスリンク時間を10分以下に短縮してください。 クロスリンクの前に別に用意したプレートの細胞数を計測し、Appendix Bを参照してクロマチンの断片化条件を最適化します。 |
3. クロマチンが過剰に断片化され、DNA断片のサイズが小さすぎる (150 bpのモノヌクレオソーム1個分の断片ばかりが検出される)。ヌクレオソーム1個分のDNAの長さになるまでクロマチンを完全に断片化すると、特に長さが150 bp以上のアンプリコンの場合、PCRでシグナルが減弱する可能性がある。 | クロマチン断片化に加えた細胞数が不十分、またはMicrococcal Nuclease量が多すぎる。 | クロスリンクの前に別に用意したプレートの細胞数を計測し、Appendix Bを参照してクロマチンの断片化条件を最適化します。 |
4. インプットDNAのPCR反応で産物が得られない、または得られる量が非常に少ない。 | PCR反応に使用したDNA量が十分でない、またはPCR条件が最適でない。 PCRの増幅領域が、ヌクレオソームフリー領域に及んでいる。 IPに加えたクロマチンが十分でない、またはクロマチンの断片化が過剰。 | PCR反応により多くのDNAを使用するか、サイクル数を増加させてください。 クロスリンク後に断片化したクロマチンから精製したDNAを用いて、プライマーセットに対する最適なPCR条件を検討してください。アンプリコンの長さが150 bp以下になるように、別のプライマーセットを設計してください (セクションIIIのプライマー設計に関する推奨事項を参照してください)。 最適なChIP結果を得るために、免疫沈降1回あたりクロマチン5-10 μgを加えてください。上記1、3の対応策も参照してください。 |
5. ポジティブコントロールであるHistone H3抗体の免疫沈降サンプルとRPL30プライマーを用いたPCR反応で増幅が起こらない。 | 免疫沈降に加えたクロマチンまたは抗体が十分でない、または免疫沈降のインキュベーション時間が短すぎる。 Protein G Beadsからのクロマチンの溶出が不十分である。 | 各免疫沈降反応にクロマチン5-10 μgと抗体10 μLを加えたことを確認して一晩インキュベートし、Protein G Beadsを加えてさらに2時間インキュベートしてください Protein G Beadsからのクロマチンの溶出には65℃が最適です。頻繁に撹拌してBeadsの懸濁状態を保ってください。 |
6. ネガティブコントロールのRabbit IgGの免疫沈降産物と、ポジティブコントロールのHistone H3抗体の免疫沈降産物で、PCRでの増幅が同程度になる。 | 免疫沈降に使用したクロマチン量が過剰、または十分でない。あるいは、免疫沈降に抗体を加えすぎている。 PCR反応に加えたDNAが多すぎる、またはサイクル数が多すぎる。 | 各免疫沈降反応に対して加える量は、クロマチン15 μg、Histone H3 antibody 10 μLを上限としてください。Normal rabbit IgG量を一回のIPあたり1 μLまで減らしてください。 PCR反応に加えるDNAを減らすか、PCRのサイクル数を減らしてください。PCRの線形増幅領域内でPCR産物を解析することが非常に重要です。そうしなければ、増幅前のDNA量の差が正確に測定できません。 |
7. 解析したいターゲットの抗体の免疫沈降産物で、PCR反応による増幅が起こらない。 | PCR反応に加えたDNA量が十分でない。 免疫沈降に使用した抗体量が十分でない。 免疫沈降ではワークしない抗体である。 | PCR反応により多くのDNAを使用するか、サイクル数を増加させてください。 通常は抗体1-5 μgを免疫沈降に加えます。しかし、実際に必要な量は抗体によって大きく異なります。 免疫沈降反応液に加える抗体の量を増やしてください。別の抗体を検討してください。 |
更新:2011年12月
改訂日:2022年4月
Protocol Id: 1184
! | この!マークは、実施するCUT&RUN反応の数に応じて量を変更する、プロトコール中の重要なステップであることを意味します。 |
!! | この!!マークは、操作を進める前にバッファーを希釈する、重要なステップであることを意味します。 |
SAFE STOP | これは、実験操作を中断する必要がある場合に、プロトコールを安全に中断できるポイントを示します。 |
ほとんどの細胞タイプにおいて、CUT&RUNアッセイに生細胞を用いることにより、ヒストンや転写因子、コファクターを安定して濃縮できます。Concanavalin Aに感受性がある、または敏感な細胞の場合は、軽く固定することにより細胞を無傷のまま保存できます。また、新鮮な細胞を用いても安定したシグナルがみられない場合は、存在量の少ない、あるいは結合力の弱い転写因子やコファクターの濃縮が、固定することによって促進される可能性があります。細胞の過剰な固定はCUT&RUNアッセイを阻害することにご注意ください。
弊社のCUT&RUNアッセイは、広範囲な細胞や組織サンプルを解析できます。プロトコールに記載されているように、1回あたり5,000-250,000個の細胞または1-5 mgの組織を用いてCUT&RUN反応を行うことができます。この範囲であれば、プロトコール全体を通して使用するバッファーの量を1反応あたりの細胞や組織の量に応じて調整する必要はありません。指示がある場合には、実施する反応の数に応じてバッファーの量を比例的に増やす必要があります。可能であれば、1反応あたり100,000個の細胞または1 mgの組織を使用することを推奨します。細胞数に限りがある場合、ヒストン修飾の解析には1反応あたり少なくとも5,000-10,000細胞、転写因子やコファクターの解析には1反応あたり10,000-20,000細胞を使用することを推奨します。
NOTE: The amount of digitonin recommended for cell permeabilization is in excess and should be sufficient for permeabilization of most cell lines and tissue types. ただし、すべての細胞株や組織が、ジギトニンに対して同じ感受性を示す訳ではありません。特定の細胞株や組織で推奨濃度のジギトニンが機能しない場合、Appendix Aのプロトコールに従って条件を最適化することができます。ジギトニン処理で90%以上の細胞が透過化される必要があります。
! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&RUN反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。
NOTE: Steps for live cell (no fixation) preparation should be performed in succession at room temperature to minimize stress on the cells. DNAの断片化を最小限にするため、再懸濁する場合には激しいボルテックスや気泡の混入を避けてください。生細胞のCUT&RUNサンプルを調製する場合、細胞が必要以上に放置される時間を最小化するため、細胞サンプルの調製を始める前にConcanavalin Aビーズ (セクションII、ステップ1 - 5) を調製することを推奨します。活性化したビーズは使用するまで氷上に保存してください。
NOTE: For adherent cells, the cells first need to be detached from the dish using Trypsin and neutralized with at least 3 volumes of tissue culture medium. スクレイパーを用いて培養皿から細胞を掻き取ると、ストレスの原因となり、細胞を溶解させてしまう場合もあるため、CSTはこれを推奨しません。適切な数の細胞を実験に用いるため、血球計算盤やその他の細胞計数装置で細胞数をカウントする必要があります。
NOTE: The challenge of working with low cell numbers (<100,000 total cells) is that the centrifuged cell pellet is not always visible by eye, making it easy to lose cells during the wash steps. したがって、少数の細胞で実験を進める場合は下記ステップ3-5の洗浄ステップの省略を推奨します。懸濁液に40%の培地が混入していても Concanavalin Aビーズと細胞は結合します。このため、ステップ2の細胞懸濁液の初めの遠心分離の段階で上清の完全除去はせず、1反応当たり40 µL以下の培地を残す方法もあります。この場合、ステップ6で細胞懸濁液に適量の1X Wash Buffer (+ Spermidine + PIC) を加え、1反応あたりの合計容量を100 µLにしてください。
NOTE: The input sample will be incubated at 55°C later in the protocol, so it is recommended to use a safe-lock 1.5 ml tube to reduce evaporation during the incubation.
NOTE: The following reagents are required for fixed cell preparation and are not included in this kit: 37% formaldehyde or 16% Formaldehyde Methanol-Free #12606, Glycine Solution (10X) #7005, and 10% SDS Solution #20533.
! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&RUN反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。
NOTE: With adherent cell lines, cells first need to be detached from the dish using Trypsin and neutralized with at least 3 volumes of medium. スクレイパーを用いて培養皿から細胞を掻き取ると、ストレスの原因となり、細胞を溶解させてしまう場合もあるため、CSTはこれを推奨しません。適切な数の細胞を実験に用いるため、血球計算盤やその他の細胞計数装置で細胞数をカウントする必要があります。
NOTE: The challenge of working with low cell numbers (<100,000 total cells) is that the centrifuged cell pellet is not always visible by eye, making it easy to lose cells during the wash steps. この場合は細胞ペレットの凍結保存を推奨しません。また、このような少数の細胞で実験を進める場合は下記ステップ5 - 7洗浄操作を省略することを推奨します。懸濁液に40%の培地が混入していても Concanavalin Aビーズと細胞は結合します。このため、ステップ4の細胞懸濁液の初めの遠心分離の段階で上清の完全除去はせず、1反応当たり40 µL以下の培地を残す方法もあります。この場合、ステップ8で細胞懸濁液に適量の1X Wash Buffer (+ Spermidine + PIC) を加え、1反応あたりの合計容量を100 µLにしてください。
NOTE: The input sample will be incubated at 55°C later in the protocol, so it is recommended to use a safe-lock 1.5 ml tube to reduce evaporation during the incubation.
ほとんどの組織タイプにおいて、軽く固定した (0.1%ホルムアルデヒドで2分間) 組織1 mgを用いることにより、ヒストンや転写因子、コファクターを安定して濃縮できます。ヒストン修飾の濃縮の場合は、ホルムアルデヒド固定は必須ではありません。しかし、多くの転写因子やコファクターの場合、軽く固定することで最適な結果が得られます。存在量の少ない、あるいは結合力の弱い転写因子やコファクターの場合、中程度の固定 (0.1%ホルムアルデヒドで10分間) が必要なこともあります。また、線維組織のような難しい組織を使用する場合には、中程度の固定によって結果が改善されることがあります。過剰な固定はCUT&RUNアッセイを阻害することにご注意ください。固定した組織は凍結し、使用するまで-80˚Cで6ヵ月間まで保存できます。
NOTE: When preparing fresh tissue (no fixation) for CUT&RUN, we recommend preparing the Concanavalin A Beads (Section II, Steps 1 to 5) prior to preparing the tissue as to minimize the amount of time the cells sit around during bead preparation. 活性化したビーズは使用するまで氷上に保存してください。
NOTE: The following reagents are required for fixed tissue preparation and are not included in this kit: 37% formaldehyde or 16% Formaldehyde Methanol-Free #12606, Phosphate Buffered Saline (PBS) #9872, Glycine Solution (10X) #7005, and 10% SDS Solution #20533.
! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&RUN反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。
NOTE: For some transcription factors or cofactors, or for difficult tissue types like fibrous tissues, up to 5 mg tissue per reaction can be used without scaling up reagents.
NOTE: We recommend light fixation of tissues because this condition works optimally for most tissue types and protein targets. しかし、新鮮な組織 (非固定) が望ましい場合は、ステップ3 - 8を省略して直ちにステップ9に進んでください。
NOTE: This volume of fixation solution is sufficient for up to 50 mg of tissue. 50 mgを超える組織を処理する場合は、固定液とステップ7の1X PBS+PIC液のスケールアップをしてください。
NOTE: For difficult tissue types (like fibrous tissues) or low abundance and/or weak binding transcription factors or cofactors, extending the formaldehyde fixation to 10 min may improve results.
NOTE: The input sample will be incubated at 55°C later in the protocol, so it is recommended to use a safe-lock 1.5 ml tube to reduce evaporation during the incubation.
! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&RUN反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。
NOTE: Digitonin Solution #16359 should be stored at -20°C. 使用中は氷上に置き、使用が終了したら-20°Cで保管してください。
NOTE: Avoid vortexing the Concanavalin A Magnetic Bead suspension as repeated vortexing may displace the Concanavalin A from the beads.
NOTE: To avoid loss of beads, remove liquid using a pipet. 真空吸引はしないでください。
NOTE: If Concanavalin A Beads are prepared prior to cell or tissue preparation, as recommended for live cells and fresh tissue, the activated beads can be stored on ice until use.
NOTE: Concanavalin A Magnetic Beads may clump or stick to the sides of the tube. ビーズはピペッティングで上下させて再懸濁してください。サンプルチューブの振盪は不要です。
NOTE: The amount of antibody required for CUT&RUN varies and should be determined by the user. ポジティブコントロールのTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mA #9751は、抗体2 µLをサンプルに加えてください。ネガティブコントロールのRabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362は、抗体5 µLをサンプルに加えてください。「抗体なし」のコントロールではMNaseによる非特異的な消化が高レベルにみられ、バックグラウンドが高くなるため、ネガティブコントロール抗体を使用することを強く推奨します。qPCR解析とNG-seq解析の両方で比較するため、インプットサンプルを使用することを推奨します。
NOTE: Concanavalin A Magnetic Beads may clump or stick to the sides of the tube. ビーズはピペッティングで上下させて再懸濁してください。サンプルチューブの振盪は不要です。
! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&RUN反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。
NOTE: Digitonin Solution #16359 should be stored at -20°C. 使用中は氷上に置き、使用が終了したら-20°Cで保管してください。
NOTE: The Digitonin Buffer prepared here will be used for both Section III and IV.
NOTE: Concanavalin A Magnetic Beads may clump or stick to the sides of the tube. ビーズはピペッティングで上下させて再懸濁してください。サンプルチューブの振盪は不要です。
! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&RUN反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。
NOTE: Digitonin Solution #16359 should be stored at -20°C. 使用中は氷上に置き、使用が終了したら-20°Cで保管してください。
Optional: Sample Normalization Spike-In DNA can be added into the 1X Stop Buffer if sample normalization is desired (for example, see Figure 8 in Section VII). qPCR解析の場合、1反応あたりSpike-In DNAを5 µL (5 ng) 加えることを推奨します。NG-seq解析の場合、Sample Normalization Spike-In DNAをNuclease-free Water #12931で100倍希釈してから、1反応あたりSpike-In DNAを5 µL (50 pg) 加えることを推奨します。1反応あたり100,000細胞または1 mgの組織を用いた場合、これによって標準化 (Spile-In) のリード数が全シーケンシングリード数の約0.5%となります。1反応あたりに用いた細胞数や組織重量が100,000 (細胞) または1 mg (組織) より多い場合や少ない場合は、標準化のリード数が全リード数の約0.5%になるように、比例計算でSample Normalization Spike-In DNAの用量を調整してください。
NOTE: Digestion should be performed in a 4°C cooling block or refrigerator. 氷の温度は0°Cまで下がることがあり、これによって消化が制限されシグナルが低減する可能性があります。サンプルチューブの振盪は不要です。
NOTE: If live cells or fresh tissues (not fixed) are used for the CUT&RUN assay, skip Steps 14-15 and immediately proceed to Step 16.
NOTE: Fixed samples will be incubated at 65°C later in the protocol, so it is recommended to use a safe-lock 2 ml tube to reduce evaporation during the incubation.
NOTE: SDS may precipitate out of solution if samples are not pre-warmed to room temperature.
下流解析でNG-sequencingを行う場合はライブラリーを調製するためにインプットDNAの断片化が必要ですが、下流解析がqPCRの場合は必須ではありません。ソニケーターを利用できない場合、qPCR解析にはインプットDNAを断片化せずに使用することを推奨しますが、断片化していないインプットDNAはサイズが大きすぎてDNAスピンカラムで精製できないので、フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿で精製する必要があります。ソニケーターが利用できず、下流解析でNG-sequencingが必要な場合は、正常IgGを用いたCUT&RUNサンプルをネガティブコントロールとして使用することもできますが、正常IgGでは非特異的にDNAが濃縮される場合があり、理想的ではありません。代替法として、MNaseを利用してインプットDNAを断片化するプロトコールをhttps://cst-science.com/CUT-RUN-input-digestionで公開しています。
! すべてのバッファーの量は、調製するインプットサンプルの数に比例して増加させる必要があります。
NOTE: Sonication conditions may need to be determined empirically by testing different sonicator power settings and/or durations of sonication, following the protocol in Appendix B. 最適なソニケーション条件では、クロマチン断片のサイズが100-600 bpの範囲になります。VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicatorで1/8インチプローブを用いた場合、出力設定6、15秒パルスを5セット行うことで、インプットクロマチンは十分に断片化されます。
DNAスピンカラム (セクションVI-A) または、フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿 (セクションVI-B) で、インプットや濃縮クロマチンサンプルからDNAを精製してください。DNAスピンカラムを用いた精製は簡便かつ迅速で、35 bp以上のDNA断片を効率良くに回収できます (図7A、レーン2)。フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿による精製は比較的煩雑ですが、35 bp以下のDNA断片も回収できます (図7A、レーン3)。ただし、図7Bに示したように、CUT&RUNアッセイで得られるほとんどのDNA断片は、35 bp以上になります。このため、DNAスピンカラムはCUT&RUN反応による全DNA断片の98%以上を精製する、迅速かつ簡便な方法と言えます。
精製したDNAはNG-seq解析に進む前に、PicoGreenによるDNA定量アッセイによって定量できます。100,000細胞を用いたCUT&RUN反応で期待されるDNAの収量は、転写因子やコファクターの場合は1反応あたり0.5-10 ng、ヒストン修飾の場合は1反応あたり1-20 ngです。
図 7 DNA精製にスピンカラムを用いた場合と、フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿を用いた場合を比較しました。(A) 低分子量のDNAラダー混合物 (レーン1、未精製) を、DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP、CUT&RUN、CUT&Tag) #14209 (レーン 2)、あるいは、フェノール/クロロホルム抽出とそれに続くエタノール沈殿 (レーン3) により精製し、4%アガロースゲルでの電気泳動により分離しました。ここで示したように、フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿はすべてのサイズのDNA断片を効率的に回収し、DNAスピンカラムは35 bp以上のDNA断片を回収できます。(B) TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569を用いたCUT&RUNアッセイで得られたDNAを、フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿で精製しました。ライブラリーのDNA断片のサイズを、Bioanalyzer (Agilent Technologies) を用いて解析しました。ライブラリーの構築で付加されたアダプター配列とバーコード配列の断片の長さは140 bpです。したがって、35 bpのDNA断片から始めると、ライブラリーの調製後には175 bpになります (図では青の垂直線で表示)。ここで示したように、断片の長さが175 bp以下 (開始長は35 bp以下) なのはCUT&RUN反応による全濃縮DNA断片の2%以下で、これは、スピンカラムを用いたDNA精製により、CUT&RUN反応による全DNA断片の98%以上が得られることを示唆しています。
NOTE: DNA can be purified from input and enriched chromatin samples using the DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN, CUT&Tag) #14209 (not included in this kit) and the modified protocol below. インプットクロマチンサンプルと濃縮クロマチンサンプル300 µLに5倍量 (1.5 mL) のDNA Binding Bufferを加える点を踏まえ、ステップ1から5までを修正しました。
NOTE: 5 volumes of DNA Binding Buffer should be used for every 1 volume of sample.
NOTE: The following reagents are required for the phenol/chloroform extraction and ethanol precipitation and are not included in this kit: phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1), chloroform/isoamyl alcohol (24:1), 3M Sodium Acetate (pH 5.2), 20mg/ml glycogen, 100% ethanol, 70% ethanol, and 1X TE buffer or Nuclease-free Water #12931.
NOTE: If sample normalization is performed, only the CUT&RUN samples are to be analyzed using the Sample Normalization Primer Set. インプットDNAにNormalization Spike-In DNAは含まれません。
試薬 | PCR反応1回分の分量 (18 μL) |
---|---|
Nuclease-free H2O #12931 | 6 µL |
5 µMのプライマー | 2 µL |
SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 | 10 µL |
a. | 初期変性 | 95°Cで3分間 |
b. | 変性 | 95°Cで15秒間 |
c. | アニーリングおよび伸長 | 60°Cで60秒間 |
d. | ステップb - cの繰り返し (合計40サイクル) |
Sample Normalization Primer SetのC[T] 値 | **qPCRの標準化係数 | 標準化前のシグナル (ステップ5で算出したPercent Input) | 標準化後のシグナル | |
サンプル1 | 23.31 | 2(23.31-23.31)=1.00 | 24.4% | 24.4%/1.00=24.4% |
サンプル2 | 24.24 | 2(23.31-24.24)=0.52 | 12.0% | 12.0%/0.52=23.1% |
サンプル3 | 25.08 | 2(23.31-25.08)=0.29 | 6.28% | 6.28%/0.29=21.7% |
サンプル4 | 26.30 | 2(23.31-26.30)=0.13 | 2.72% | 2.72%/0.13=20.9% |
**qPCRの標準化係数 = 2 (C[T] 選択したサンプル –C[T] その他のサンプル)
図 8 qPCR解析におけるSpike-In DNAを用いたCUT&RUNシグナルの標準化。細胞数の異なるHCT116細胞を用い、Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 (上パネル) またはPhospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499 (下パネル) でCUT&RUNを実施しました。濃縮されたDNAを、SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516、SimpleChIP® Human β-Actin Promoter Primers #13653、SimpleChIP® Human Β-Actin 3' UTR Primers #13669、SimpleChIP® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490を用いたリアルタイムPCRで解析しました。各サンプルで回収されたDNAの量を、100,000細胞のインプットクロマチン総量 (1に相当) に対する相対量で示しました。標準化前の濃縮結果を左のパネルに示しました。最初の細胞数に比例させた量のSample Normalization Spike-In DNAを、各反応に加えました。各サンプルのSpike-In DNAのqPCR結果に基づき、CUT&RUNシグナルを100,000細胞のサンプルで標準化しました。標準化後の濃縮結果を右のパネルに示しました。
CUT&RUNキットを用いて調製したDNAサンプルは、直接NG-seqに使用できます。NG-seq用のDNAライブラリーの調製には、下流のシーケンシングプラットフォームに対応するプロトコールやキットを使用してください。Illumina®プラットフォームによるシーケンシングの場合は、DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795を、Multiplex Oligos for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580または#47538と共に、CUT&RUN DNAのプロトコールに従って使用することを推奨します。
酵母にアラインメントしたユニークリード数 | NGSの標準化係数 | 解析対象のリファレンスゲノムにアラインメントしたユニークリード数 (標準化前) | 解析対象のリファレンスゲノムにアラインメントしたユニークリード数 (標準化後) | |
サンプル1 | 219,275 | 219,275/219,275 = 1.00 | 5,077,747 | 5,077,747 X 1.00 = 5,077,747 |
サンプル2 | 411,915 | 219,275/411,915 = 0.53 | 9,896,671 | 9,896,671 X 0.53 = 5,268,306 |
サンプル3 | 816,235 | 219,275/816,235 = 0.27 | 17,842,773 | 17,842,773 X 0.27 = 4,793,320 |
サンプル4 | 1,120,826 | 219,275/1,120,826 = 0.20 | 23,836,679 | 23,836,679 X 0.20 = 4,663,339 |
NGSの標準化係数 = 選択したサンプルの酵母のユニークリードの数 / その他のサンプルの酵母のユニークリードの数
CUT&RUNプロトコールでは、ジギトニンをバッファーに添加することで細胞膜を透過化し、一次抗体やpAG-MNaseの細胞や核への進入を促進します。このため、バッファーが適量のジギトニンを含むことは、抗体と酵素の結合および標的ゲノム遺伝子座の消化に不可欠です。異なる細胞株は、ジギトニンの細胞透過化に対して異なる感受性を示します。本プロトコールで推奨されているジギトニンの量は、ほとんどの細胞株や組織の透過化に十分ですが、下記のプロトコールを用いて、使用する特定の細胞株や組織のジギトニン感受性試験を行うことができます。過剰なジギトニンの添加はアッセイに対して有害ではないことが分かっていますので、濃度曲線を作成する必要はありません。推奨されるジギトニンの量が使用する細胞株に十分かどうかを、簡単な試験により判断します。
NOTE: Digitonin Solution #16359 should be stored at -20°C. 使用中は氷上に置き、使用が終了したら-20°Cで保管してください。
NOTE: If the cell pellet is not visible by eye, we recommend removing as much cell medium as possible without disturbing the cell pellet after the initial centrifugation of the cell suspension in Step 2 and leave behind some cell medium per reaction. 続くステップ3で、適量の1X Wash Bufferを加え、細胞懸濁液の総量を100 µLにしてください。
DNAスピンカラムを使用して精製できるのは、10 kb以下に断片化されたゲノムDNAだけであることから、インプットDNAサンプルのソニケーションを推奨します。1 kb以下に断片化されたゲノムDNAは、NG-seq解析でネガティブコントロールとして使用できます。インプットDNAの長さが100-600 bpになるように、ソニケーションを最適化する必要があります。
NG-seqのコントロールには、インプットサンプルを使用することを推奨します。インプットサンプルは、偏りのない細胞ゲノムの代表として簡便に使用できるからです。IgGサンプルもNG-seqのネガティブコントロールとして使用できますが、非特異的な結合によりゲノムの特定領域で濃縮が見られる場合があります。qPCR解析の場合は、インプットDNAを断片化せずに使用することができます。ただし、断片化されていないDNAは、フェノール・クロロホルム抽出とエタノール沈殿によって精製する必要があります。
! すべてのバッファーの量は、調製するインプットサンプルの数に比例して増加させる必要があります。
NOTE: If the centrifuged cell pellet is not visible by eye when working with low cell numbers (<100,000 cells), we recommend skipping the wash steps 3-5 below. ステップ2で細胞懸濁液を最初に遠心分離した後、ペレットを崩さない程度になるべく多くの培地を除去し、培地をいくらか残すことを推奨します。この場合、ステップ6で細胞懸濁液に適量の1X Wash Bufferを加え、各ソニケーション条件あたりの合計容量を100 µLにしてください。
NOTE: Samples will be incubated at 55°C in Step 9, so it is recommended to use a safe-lock 1.5 ml tube to reduce evaporation during the incubation.
詳細なトラブルシューティングガイドについては、https://cst-science.com/troubleshooting-CUT-RUNをご覧ください。
Protocol Id: 1884
! | この!マークは、実施中のCUT&Tag反応の数に応じて量を変更する、プロトコールの重要なステップであることを意味します。 |
!! | この!!マークは、操作を進める前にバッファーを希釈する、重要なステップであることを意味します。 |
SAFE STOP | これは、実験操作を中断する必要がある場合に、プロトコールを安全に中断できるポイントを示します。 |
! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。
Concanavalin A Bead Activation Bufferを氷上に置いてください。
実行するCUT&Tag反応の数を決めます。ポジティブコントロール、Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751の反応も含めることを強く推奨します。使用するピーク抽出アルゴリズムの要件に応じて、ネガティブコントロール、Normal Rabbit IgG #2729またはNormal Mouse IgG #68860の使用も検討してください。
Concanavalin A磁気ビーズを、チューブからこぼれないように慎重にピペッティングで上下させて、均一な懸濁液 (粘り気あり) になるまで再懸濁してください。
注:ボルテックスを繰り返すとConcanavalin Aがビーズから外れてしまう場合があります。Concanavalin A磁気ビーズは、プロトコールのいずれの時点でもボルテックスしないでください。
CUT&Tag 1反応あたりビーズ懸濁液10 µLを、新しい1.5 mLチューブに移してください。一度に14サンプルを超えるCUT&Tag反応を行う場合は、2本以上の1.5 mLチューブを使用してください。各1.5 mLチューブに140 µL以上のConcanavalin Aビーズを入れないでください。
ビーズ懸濁液10 µLにつきConcanavalin A Bead Activation Buffer 100 µLを加えてください。ピペッティングで穏やかに上下させてビーズを混合してください。
チューブを磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後ピペットを使用して上清を除去します。
注: ビーズの損失を避けるため、プロトコールのいずれの時点においても真空吸引はしないでください。
チューブを磁気ラックから外してください。ステップ4と5を繰り返して、2回目のビーズの洗浄を実施してください。
ビーズ懸濁液の最初の量と同量 (1反応あたり10 µL) のConcanavalin A Bead Activation Bufferを加えて、ピペッティングで上下させて再懸濁してください。
注:活性化したビーズは氷上で最長8時間保管できます。
ほとんどの細胞タイプにおいて、生細胞をCUT&Tagアッセイに用いることにより、ヒストンや転写因子、コファクターを安定して濃縮できます。可能な限り生細胞を用いることを強く推奨します。Concanavalin Aに感受性がある、または敏感な細胞の場合は、CUT&Tag実験前に細胞を軽く固定するプロトコールのAppendix Aを参照してください。細胞の固定は、CUT&Tagシグナルを増加させるわけではなく、過剰な固定はタグメンテーション反応にとって有害であることにご注意ください。
また、新鮮な組織をCUT&Tagアッセイに用いることにより、ヒストンを安定して濃縮できます。ただし、組織内の転写因子やコファクターなどのヒストン以外の標的は、CUT&Tagアッセイでは十分に濃縮されません。組織内の転写因子やコファクターの解析には、CUT&RUN Assay Kit #86652の使用を推奨します。通常、新鮮な組織では、固定組織と同等またはより強力なCUT&Tagシグナルが得られます。固定が必要な場合は、CUT&Tag実験前に細胞を軽く固定するプロトコールのAppendix Bを参照してください。
弊社のCUT&Tagアッセイは、様々な細胞や組織サンプルを解析できます。また、幅広いサンプル量でアッセイを開始できます。1反応あたり100,000個の細胞または1 mgの組織を使用することを推奨します。アッセイ開始時のサンプル量が限られる場合、標的がヒストン修飾であれば1反応あたりわずか5,000-10,000個の細胞、転写因子やコファクターであればわずか20,000個の細胞から始める解析も可能かもしれません。少ないインプットでの反応の成否は、標的の存在量と抗体の感度に依存します。特に転写因子とコファクターの場合、目的のCUT&Tagシグナルを得るにはアッセイ開始時のサンプル量が十分であることが不可欠です。1反応あたり、最大250,000個の細胞または5 mgの組織まで使用できます。指定された範囲内 (5,000-250,000細胞または1-5 mgの組織) であれば、全プロトコールにわたる1反応あたりのバッファーの量を、細胞数や組織の重量に応じて調節する必要はありません。指示がある場合は、実施する反応の数に応じて、比例的にバッファーの量を増やす必要があります。
細胞の透過化に用いるジギトニンの推奨量は過剰量であり、ほとんどの細胞株や組織を十分に透過化できます。ただし、すべての細胞株や組織が、ジギトニンに対して同じ感受性を示す訳ではありません。特定の細胞株や組織で推奨濃度のジギトニンが機能しない場合は、Appendix Cのプロトコールに従って条件を最適化してください。ジギトニン処理で90%以上の細胞が透過化される必要があります。
! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。
使用前に200X Protease Inhibitor Cocktail #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、使用後は-20°Cで保管してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。
Complete Wash Buffer (細胞調製1サンプルあたり2 mL、さらにCUT&Tag 1反応あたり100 µLが必要) を調製し、室温で保持します。例えば、未処理および薬剤処理した細胞の両方 (2サンプルの細胞調製) と、4種類の抗体 (ポジティブコントロールのH3K4me3 #9751、ネガティブコントロールのIgG #2729または#68860、および2種類の実験用抗体) を用いた8反応で試験する場合、合計4.8 mLのComplete Wash Bufferが必要です。
Complete Wash Buffer |
量 (1サンプルあたり) |
量 (1反応あたり) |
総量 |
10X Wash buffer (CUT&RUN, CUT&Tag) #31415 |
200 µL |
10 µL |
両方のカラムを足した量が、必要となる各試薬の総量です。 |
100X Spermidine #27287 |
20 µL |
1 µL |
|
Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 |
10 µL |
0.5 µL |
|
Nuclease-free Water #12931 |
1770 µL |
88.5 µL |
注:生細胞サンプルの調製ステップは、細胞へのストレスを最小限にするため、すべて室温で連続して行う必要があります。DNAの断片化や気泡の混入を最小限にするために、ボルテックスの使用は避けてください。
細胞のストレスを最小限にするため、1反応あたり100,000個の生細胞を用意します。
注:接着細胞を回収する場合は、トリプシン処理で細胞を培養皿から剥離させた後、3倍量以上の組織培養液で反応を停止させてください。スクレイパーを用いて培養皿から細胞を掻き取ると細胞を溶解させてしまう場合もあるため、CSTはこれを推奨しません。正確な数の細胞を実験に用いるため、血球計算盤やその他の細胞計数装置で細胞数を正確にカウントする必要があります。
細胞懸濁液を600 x gで3分間、室温で遠心分離して、上清を除去してください。
注: 使用細胞数が少なく (100,000個未満)、遠心分離で集めた細胞ペレットが肉眼で確認できない場合は、下記のステップ3-5を省略し、すぐにステップ6を行うことを推奨します。ステップ2の細胞懸濁液の最初の遠心分離の段階で、上清の完全除去はせず、1反応あたり40 µL以下の上清を残す方法もあります。続くステップ6で、適量のComplete Wash Bufferを加え、細胞懸濁液の総量を1反応あたり100 µLにしてください。
室温のComplete Wash Buffer 1 mLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
600 x gで3分間、室温で遠心分離して、液体を除去してください。
ステップ3と4を繰り返して、2度目の細胞ペレットの洗浄を実施してください。
1反応あたりComplete Wash Buffer 100 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
速やかにセクションIIIに進んでください。
! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。
使用前に200X Protease Inhibitor Cocktail #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、使用後は-20°Cで保管してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。
Complete Wash Buffer (組織調製1サンプルあたり3 mL、さらに1反応あたり100 µLが必要) を調製し、細胞のストレスを最小限にするため室温で保持してください。例えば、野生型および遺伝子導入した肝臓サンプル (2種類の組織) と、4種類の抗体 (ポジティブコントロールのH3K4me3 #9751、ネガティブコントロールのIgG #2729または#68860、および2種類の実験抗体) を用いて8反応で試験する場合、合計6.8 mLのComplete Wash Bufferが必要です。
Complete Wash Buffer |
量 (1組織あたり) |
量 (1反応あたり) |
総量 |
10X Wash buffer (CUT&RUN, CUT&Tag) #31415 |
300 µL |
10 µL |
両方のカラムを足した量が、必要となる各試薬の総量です。 |
100X Spermidine #27287 |
30 µL |
1 µL |
|
Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 |
15 µL |
0.5 µL |
|
Nuclease-free Water #12931 |
2655 µL |
88.5 µL |
新鮮な組織を、1反応あたり1 mg測り取ります。
組織サンプルをシャーレに置き、清潔な解剖用メスまたは剃刀の刃で細かく切り刻んでください。シャーレは氷上に置いてください。タンパク質分解を防ぐため、組織をよく冷やす必要があります。
組織をComplete Wash Buffer 1 mLに再懸濁し、サンプルをダウンスホモジナイザーに移してください。
組織片を、シングルセル懸濁液になるまで破砕してください。20-25ストロークで、組織の塊が見られなくなるまでホモジナイズしてください。
細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、3,000 x gで3分間、室温で遠心分離して、細胞から上清をピペットで除去してください。
Complete Wash Buffer 1 mLで細胞ペレットを再懸濁してください。
細胞懸濁液を3,000 x gで3分間、室温で遠心分離して、上清を除去してください。
ステップ6と7を繰り返して、2度目の細胞ペレットの洗浄を実施してください。
1反応あたりComplete Wash Buffer 100 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
速やかにセクションIIIに進んでください。
注:セクションIII-Vのすべてのインキュベーションステップにおいて、振盪または回転によってサンプルを攪拌させる必要はなく、指定の温度でチューブラック上に静置することを推奨します。インキュベーションステップ中にサンプルを攪拌することでアッセイの性能が向上することはなく、サンプルを回転させたり振盪させたりすると、ビーズがチューブ壁やキャップに付着し、凝集や損失につながる可能性があります。
! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。
Digitonin Solution #16359を90-100°Cで5分間温め、完全に解凍および溶解されていることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359はすぐに氷上に置き、使用中は氷上で保持してください。使用後は-20°Cで保管してください。
使用前に200X Protease Inhibitor Cocktail #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、使用後は-20°Cで保管してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。
1反応あたりComplete Antibody Binding Buffer 100 µLを加えて、氷上に置いてください。
Complete Antibody Binding Buffer |
量 (1反応あたり) |
Antibody Binding Buffer (CUT&RUN, CUT&Tag) #15338 |
96 µL |
100X Spermidine #27287 |
1 µL |
Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 |
0.5 µL |
Digitonin Solution #16359 |
2.5 µL |
セクションIのステップ7で調製済みの活性化したConcanavalin Aビーズを、ピペッティングで穏やかに上下させて攪拌してください。セクションII-Aステップ6またはセクションII-Bステップ9で調製および洗浄した細胞懸濁液に、ビーズ懸濁液を加えてください。
サンプルを室温で5分間インキュベートしてください。
チューブを磁気ラックに30秒間から2分間置き、その後上清を除去してください。
チューブを磁気から外してください。1反応あたり100 µLのComplete Antibody Binding Bufferを加えて、ピペッティングで穏やかに攪拌してください。
細胞とビーズの懸濁液100 µLを1反応分として、別々の1.5 mLチューブに分注して氷上に置いてください。
各チューブに適量の一次抗体を加えて、ピペッティングで上下させて穏やかに混合してください。
注:CUT&Tag反応に必要な抗体の量は異なりますので、それぞれに決定する必要があります。ポジティブコントロールのTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751、もしくはネガティブコントロールのRabbit IgG #2729またはNormal Mouse IgG #68860の場合は、1反応あたり2 µLの抗体を加えてください。可能な限り、アッセイにCUT&Tag検証済み抗体を使用することを強く推奨します。CSTは、サポートデータの閲覧が可能な、適切な希釈率を決定済みの様々なCUT&Tag検証済み抗体を提供しています。
サンプルを室温で1時間インキュベートしてください。このステップは4°Cで一晩まで延長できます。
速やかにセクションIVに進んでください。
! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。
Digitonin Solution #16359を90-100°Cで5分間温め、完全に解凍および溶解されていることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359はすぐに氷上に置き、使用中は氷上で保持してください。使用後は-20°Cで保管してください。
使用前に200X Protease Inhibitor Cocktail #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、使用後は-20°Cで保管してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。
1反応あたり1.05 mLのDigitonin Bufferを新たに調製して氷上に置いてください。
NOTE: Digitonin Buffer prepared here will be used for both Section IV and V.
Digitonin Buffer |
量 (1反応あたり) |
10X Wash buffer (CUT&RUN, CUT&Tag) #31415 |
105 µL |
100X Spermidine #27287 |
10.5 µL |
Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 |
5.25 µL |
Digitonin Solution #16359 |
26.25 µL |
Nuclease-free Water #12931 |
903 µL |
二次抗体のプレミックスを作ります。1反応あたりGoat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody #35401 1 µL、またはDonkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody #52885 1 µLを50 µLのDigitonin Bufferで希釈します。反応の数に応じて、二次抗体プレミックスを比例的に増やしてください。穏やかにピペッティングで上下させて攪拌し、氷上に置いてください。
セクションIIIステップ7の、一次抗体の入ったサンプルチューブを磁気ラックに30秒間から2分間置き、その後上清を除去してください。
各サンプルチューブに二次抗体プレミックス50 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させてサンプルを混合してください。
サンプルを室温で30分間インキュベートしてください。
速やかにセクションVに進んでください。
! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。
10% SDS Solution #20533が完全に溶解していることを確認してください。37°Cに温めることでSDSの沈殿が溶解しやすくなります。
Digitonin Solution #16359を90-100°Cで5分間温め、完全に解凍および溶解されていることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359はすぐに氷上に置き、使用中は氷上で保持してください。使用後は-20°Cで保管してください。
使用前に200X Protease Inhibitor Cocktail #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、使用後は-20°Cで保管してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。
1反応あたりHigh Salt Digitonin Buffer 1.2 mLを加えて、氷上に置いてください。
High Salt Digitonin Buffer |
量 (1反応あたり) |
10X High Salt Wash Buffer (CUT&Tag) |
120 µL |
100X Spermidine #27287 |
12 µL |
Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 |
6 µL |
Digitonin Solution #16359 |
30 µL |
Nuclease-free Water #12931 |
1032 µL |
1反応あたりTagmentation Buffer 150 µLを加えて、氷上に置いてください。
Tagmentation Buffer |
量 (1反応あたり) |
High Salt Digitonin Buffer (上記の通り) |
148.5 µL |
塩化マグネシウム |
1.5 µL |
1反応あたり、CUT&Tag pAG-Tn5 (Loaded) #79561 2 µLをHigh Salt Digitonin Buffer 50 µLで希釈して、pAG-Tn5プレミックスを調製してください。反応の数に応じて、pAG-Tn5プレミックスを比例的に増やしてください。ピペッティングで上下させて穏やかに混合し、氷上に置いてください。
セクションIVステップ4の、二次抗体をインキュベーションした溶液の入ったサンプルチューブを磁気ラックに30秒間から2分間置き、その後上清を除去してください。
チューブを磁気ラックから外してください。セクションIVで調製したジギトニンバッファー500 µLを加えてください。ピペッティングで穏やかに上下させてビーズを再懸濁してください。
チューブを30秒間から2分間磁気ラックに置き、その後上清を除去してください。
ステップ3と4をもう1度繰り返し、2度目の洗浄を実施してください。
チューブを磁気ラックから外してください。各チューブにpAG-Tn5プレミックス50 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させてサンプルを混合してください。
室温で1時間インキュベートしてください。
チューブを30秒間から2分間Magnetic Separation Rackに置き、その後上清を除去してください。
チューブを磁気分離ラックから外してください。High Salt Digitonin Buffer 500 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させてビーズを再懸濁してください。
チューブを30秒間から2分間磁気ラックに置き、その後上清を除去してください。
ステップ9と10をもう1度繰り返し、2度目の洗浄を実施してください。
チューブを磁気ラックから外してください。各チューブにTagmentation Buffer 150 µLを加えて、ピペッティングで上下させて混合してください。
サンプルを37°Cで1時間、インキュベートしてください。
タグメンテーションを停止するには、各サンプルに0.5 M EDTA #7011 6.75 µL、10% SDS #20533 8.25 µL、20 mg/mL Proteinase K #10012 1.5 µLを加え、軽くボルテックスして攪拌してください。
サンプルを58°Cで1時間インキュベートして、タグ付けされたクロマチン断片を溶液中に放出させてください。インキュベーションは一晩まで延長することができます。一晩インキュベートする場合は、サンプルの蒸発を防ぐためにセーフロックチューブを使用してください。
注:固定細胞または組織サンプルの場合、十分に脱クロスリンクするために65°Cで2時間、サンプルをセーフロックチューブでインキュベートしてください。このインキュベーションは一晩行えます。
チューブを16,000 x gで2分間、室温で遠心分離し、2秒間から30分間磁気ラックに置いてください。
上清を新しい1.5 mLチューブに移してください。これが、精製前のCUT&Tag DNAサンプルです。
セクションVIに進んでください。(SAFE STOP) サンプルを-20℃で保存できます (最長1週間)。ただし、DNAの精製 (セクションVI) に移る前に、サンプルを必ず室温まで温めてください。
DNA Purification Columns、DNA Binding Buffer、DNA Wash Buffer、DNA Elution Bufferを、使用前に室温に平衡化してください。
!! 使用前に、DNA Wash Bufferにエタノール (96-100%) 24 mLを加えてください。本ステップは、DNA精製の最初のセッティング前に1度だけ実施してください。
精製するCUT&Tag DNA 1サンプルあり、DNA Purification Collection Tube1個を使用してください。
各CUT&Tag DNAサンプルにDNA Binding Buffer 833 µLを加え、ピペッティングで上下させて混合してください。
注:1サンプルあたり5倍量のDNA Binding Bufferを使用します。
ステップ1のサンプル600 μLを、コレクションチューブにセットしたDNAスピンカラムに移してください。
18,500 x gで30秒間遠心分離してください。
コレクションチューブからスピンカラムを取り外し、液体を廃棄してください。空になったコレクションチューブにスピンカラムを再セットしてください。
ステップ2-4を繰り返し、ステップ1のサンプル (1.5 mL) をすべてカラムにロードしてください。空になったコレクションチューブにスピンカラムを再セットしてください。
DNA Wash Buffer 750 μLを、コレクションチューブにセットしたスピンカラムに加えてください。
18,500 x gで30秒間遠心分離してください。
コレクションチューブからスピンカラムを取り外し、液体を廃棄してください。空になったコレクションチューブにスピンカラムを再セットしてください。
18,500 x gで30秒間遠心分離してください。
コレクションチューブと液体を廃棄してください。スピンカラムは廃棄しないでください。
スピンカラムにDNA Elution Buffer 30 μLを加え、新しい1.5 mLチューブにセットしてください。
注:カラムからDNAを完全に溶出するには、最低30 µLのDNA Elution Bufferが必要です。
18,500 x gで30秒間遠心分離して、DNAを溶出してください。
DNAスピンカラムを取り外し、廃棄してください。得られた溶出液が精製されたDNAです。(SAFE STOP) サンプルは-20℃で最長6か月間保存可能です。
注:CUT&Tag DNAの収量は一般的に低いことを考慮し、ライブラリー増幅にDNAサンプル30 µLをすべて使用することを強く推奨します。
本キットを用いて調製したDNAサンプルは、直接NG-seqに使用できます。NG-seq用のDNAライブラリーの調製には、下流のシーケンシングプラットフォームに対応するプロトコールやキットを使用してください。Illumina Systemsプラットフォームでのシーケンシングの場合、CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina #47415の使用を推奨します。DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795、およびMultiplex Oligos for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580または#47538は、CUT&Tag DNAサンプルに適していません。
DNAライブラリーの調製に関するその他の推奨事項:
増幅されたCUT&Tag DNAライブラリーの収量は、用いるDNA定量の手法によって異なります。NanoDropまたはQIAxpert Systemを使用する場合、予想されるライブラリー濃度は、標的がヒストンであれば10-20 ng/µL、ヒストン以外であれば5-12 ng/µLです。NanoDropまたはQIAxpert Systemでのライブラリー濃度が3 ng/µL以下である場合は、サンプルをシーケンシングする前にトラブルシューティングガイドを参照してください。Qubit Fluorometric Quantification systemまたはPicogreenアッセイを使用する場合、予想されるライブラリー濃度は、標的がヒストンであれば3-10 ng/µL、ヒストン以外であれば1 ng/µL以下です。低濃度のため、BioanalyzerまたはTapeStationシステムでは、特に細胞内の存在量が低い標的の場合に、ピークが非常に弱いまたはピークがみられないプロファイルを示す可能性があります。そのような場合でも、Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751などのポジティブコントロールで期待通りのライブラリーの収量が得られる、またはBioanalyzerでピークが得られる、またはその両方であれば実験は成功しているため、NGSでの解析に進むことを推奨します。CUT&Tagのよくある質問のページを参照して、サポートデータや、収量が異なるサンプルを混合する際の注意事項をご覧ください。
標的の種類に関わらず、シーケンシング深度は通常1サンプルあたり200万リードで十分です。シーケンシング深度が1サンプルあたり1,500万以上の場合、リードの重複率が大幅に上昇します。シーケンシング深度が1サンプルあたり100万未満の場合は、S/N比が低下します。
使用した細胞数が20,000個未満の場合は、一般的にNGSで得られるリードのマッピング率が低下するか、重複率が上昇します。このような場合、下流のデータ解析に十分な量のマッピングされた個々のリードを得るために、シーケンシング深度を上げることを推奨します。
可能な限り生細胞を用いることを強く推奨します。Concanavalin Aに感受性がある、あるいは敏感なタイプの細胞の場合は、CUT&Tag実験前に細胞を軽く固定する下記のプロトコールを参照してください。細胞の固定は、CUT&Tagシグナルを大幅に増加させるわけではないことにご注意ください。過剰な固定は、CUT&Tagのシグナルを弱める可能性があります。各反応に用いる適切な細胞数を決定するには、セクションIIに記載の内容を参照してください。
注:固定細胞サンプルの調製には、本キットに含まれない次の試薬が必要です:37% Formaldehydeまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606、Glycine Solution (10X) #7005
! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。
固定処理を行う細胞懸濁液1 mLあたり、37% Formaldehydeを2.7 µLまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606を6.25 µL取り分け、室温で保持してください。使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。
使用前に200X Protease Inhibitor Cocktail #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、使用後は-20°Cで保管してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。
Complete Wash Buffer (細胞調製1サンプルあたり2 mL、さらにCUT&Tag 1反応あたり100 µLが必要) を調製し、室温で保持します。例えば、未処理および薬剤処理した細胞 (2サンプルの細胞調製) と、4種類の抗体 (ポジティブコントロールのH3K4me3 #9751、ネガティブコントロールのIgG #2729または#68860、および2つの実験抗体) を用いて8反応で試験する場合、合計4.8 mLのComplete Wash Bufferが必要です。
Complete Wash Buffer |
量 (1サンプルあたり) |
量 (1反応あたり) |
総量 |
10X Wash buffer (CUT&RUN, CUT&Tag) #31415 |
200 µL |
10 µL |
両方のカラムを足した量が、必要となる各試薬の総量です。 |
100X Spermidine #27287 |
20 µL |
1 µL |
|
Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 |
10 µL |
0.5 µL |
|
Nuclease-free Water #12931 |
1770 µL |
88.5 µL |
1反応あたり100,000個の生細胞を用意します。
注:接着細胞を回収する場合は、トリプシン処理で細胞を培養皿から剥離させた後、3倍量以上の組織培養液で反応を停止してください。スクレイパーを用いて培養皿から細胞を掻き取ると細胞を溶解させてしまう場合もあるため、CSTはこれを推奨しません。適切な数の細胞を実験に用いるため、血球計算盤やその他の細胞計数装置で細胞数を正確にカウントする必要があります。
細胞懸濁液1 mLあたり、37% Formaldehydeを2.7 µLまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606を6.25 µL加え、ホルムアルデヒドの終濃度が0.1%となるように調整してください。チューブを転倒混和しながら室温で2分間インキュベートしてください。
固定処理した細胞懸濁液1 mLあたり、Glycine Solution (10X) #7005を100 µL加え、クロスリンクを停止してください。チューブを転倒混和しながら室温で5分間インキュベートしてください。
細胞懸濁液を3,000 x gで3分間、4°Cで遠心分離して、上清を除去してください。速やかにステップ5に進んでください。(SAFE STOP) 固定した細胞ペレットは、使用するまで-80°Cで6か月間保存できます。
注:使用細胞数が少なく (100,000個未満)、遠心分離で集めた細胞ペレットが肉眼で確認できない場合は、細胞ペレットの凍結保存を推奨しません。代わりに、プロトコールを継続して下記の洗浄ステップ5-7を省略することを推奨します。ステップ4で行う最初の遠心分離の段階で上清の完全除去はせず、1反応あたり40 µL以下の培地を残す方法もあります。続くステップ8で、適量のComplete Wash Bufferを加え、細胞懸濁液の総量を1反応あたり100 µLにしてください。
Complete Wash Buffer 1 mLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
3,000 x gで3分間、4°Cで遠心分離して、上清を除去してください。
ステップ5と6を繰り返して、2度目の細胞ペレットの洗浄を実施してください。
1反応あたりComplete Wash Buffer 100 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
速やかにセクションIIIに進んでください。
大半の組織タイプにおいて、1 mgの新鮮な組織でヒストンを十分に濃縮できます。新鮮な組織が使用できない場合は、軽く固定した組織 (0.1%ホルムアルデヒドで2分間) を使用します。固定した組織サンプルは、凍結することにより使用するまで-80˚Cで6か月間まで保存できます。CUT&Tagアッセイは、組織の転写因子およびコファクターの濃縮には向いていません。転写因子およびコファクターの解析には、CUT&RUN Assay Kit #86652の使用を推奨します。
注:固定組織サンプルの調製には、本キットに含まれない次の試薬が必要です:37%ホルムアルデヒドまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606、Phosphate Buffered Saline (PBS) #9872、およびGlycine Solution (10X) #7005
! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。
固定処理を行う細胞懸濁液1 mLあたり、37% Formaldehydeを2.7 µLまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606を6.25 µL取り分け、室温で保持してください。使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。
固定バッファー1 mLあたり、Glycine Solution (10X) #7005 100 µLを準備してください。
使用前に200X Protease Inhibitor Cocktail #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、使用後は-20°Cで保管してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。
Complete Wash Buffer (組織調製1サンプルあたり3 mL、さらに1反応あたり100 µLが必要) を調製し、細胞のストレスを最小限にするために室温で保持してください。
Complete Wash Buffer |
量 (1組織あたり) |
量 (1反応あたり) |
総量 |
10X Wash buffer (CUT&RUN, CUT&Tag) #31415 |
300 µL |
10 µL |
両方のカラムを足した量が、必要となる各試薬の総量です。 |
100X Spermidine #27287 |
30 µL |
1 µL |
|
Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 |
15 µL |
0.5 µL |
|
Nuclease-free Water #12931 |
2655 µL |
88.5 µL |
細胞1サンプルあたり1 mLの固定バッファーを調製してください。使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。
固定バッファー |
量 (1組織あたり) |
ホルムアルデヒド |
37%を2.7 µLまたは16%を6.25 µL |
Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 |
5 µL |
Phosphate Buffered Saline (PBS) #9872 |
992.3 µL |
1組織あたりFixation Wash Bufferを1 mL調製し、氷上に置いてください。
Fixation Wash Buffer |
量 (1組織あたり) |
Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012 |
5 µL |
Phosphate Buffered Saline (PBS) #9872 |
995 µL |
1反応あたり新鮮な組織を1 mg測り取ってください。
組織サンプルをシャーレに置き、清潔な解剖用メスまたは剃刀の刃で細かく切り刻んでください。シャーレは氷上に置いてください。タンパク質分解を防ぐため、組織をよく冷やす必要があります。
刻んだ組織を速やかにFixation Buffer 1 mLに移し、チューブを転倒混和してください。
注:この容量の固定液で50 mgまでの組織を固定処理できます。50 mgを超える組織を処理する場合は、ステップ3のFixation Bufferとステップ7のFixation Wash Bufferを適切にスケールアップをしてください。
室温で2分間インキュベートしてください。
Fixation Buffer1 mLあたり、Glycine Solution (10X) #7005を100 µL加え、クロスリンクを停止してください。チューブを転倒混和しながら室温で5分間インキュベートしてください。
2,000 x gで5分間、4°Cで遠心分離して、上清を除去してください。
組織をFixation Wash Buffer 1 mLに再懸濁します。
2,000 x gで5分間、4°Cで遠心分離して上清を除去し、ステップ9に進んでください。(SAFE STOP) 固定した細胞ペレットは、使用するまで-80°Cで6か月間保存できます。
組織をComplete Wash Buffer 1 mLに再懸濁し、サンプルをダウンスホモジナイザーに移してください。
組織片を、シングルセル懸濁液になるまで破砕してください。20-25ストロークで、組織の塊が見られなくなるまでホモジナイズしてください。
細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、3,000 x gで3分間、室温で遠心分離して、細胞から上清を除去してください。
Complete Wash Buffer 1 mLで細胞ペレットを再懸濁してください。
細胞懸濁液を3,000 x gで3分間、室温で遠心分離して、上清を除去してください。
ステップ12と13を繰り返して、2度目の細胞ペレットの洗浄を実施してください。
1反応あたりComplete Wash Buffer 100 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
速やかにセクションIIIに進んでください。
CUT&Tagプロトコールでは、ジギトニンをバッファーに添加することで細胞膜を透過化し、一次抗体や二次抗体、pAG-Tn5酵素の細胞や核への進入を促進します。このため、バッファーが適量のジギトニンを含むことは、抗体と酵素の結合および標的ゲノム遺伝子座の切断に不可欠です。異なる細胞株は、ジギトニンの細胞透過化に対して異なる感受性を示します。本プロトコールで推奨されているジギトニンの量は、ほとんどの細胞株や組織の透過化に十分ですが、下記のプロトコールを用いて、使用する特定の細胞株や組織のジギトニン感受性試験を行うことができます。過剰なジギトニンの添加はアッセイに対して有害ではないことが分かっていますので、濃度曲線を作成する必要はありません。推奨されるジギトニンの量が使用する細胞株に十分かどうかを、簡単な試験により判断します。
Digitonin Solution #16359を90-100°Cで5分間温め、完全に解凍および溶解されていることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359はすぐに氷上に置き、使用中は氷上で保持してください。使用後は-20°Cで保管してください。
1反応あたり100 µLの1X Wash Bufferを調製してください。この試験では、SpermidineやProtease Inhibitor Cocktailをバッファーに加える必要はありません。
1X Wash Buffer |
量 (1反応あたり) |
10X Wash Buffer (CUT&RUN, CUT&Tag) #31415 |
10 µL |
Nuclease-free Water #12931 |
90 µL |
1.5 mLチューブ内に100,000個の細胞を回収し (セクションII-Aのステップ1)、600 x gで3分間、室温で遠心分離し、上清を除去してください。組織の場合は、1 mgの組織から解離した細胞を回収してください (セクションII-B、ステップ1-8)。
1X Wash Buffer 100 µLに細胞ペレットを再懸濁してください。
1反応あたり、Digitonin Solution #16359を2.5 µL加え、室温で10分間インキュベートしてください。
細胞懸濁液10 µLと0.4% Trypan Blue 10 µLを混合してください。
血球計算盤またはセルカウンターを使用して、染色された細胞数と総細胞数を計測してください。透過化が十分であれば、90%以上の細胞がTrypan Blueで染色されます。
Trypan Blueで染色された細胞数が90%未満の場合は、各反応に加えるDigitonin Solution #16359の量を増加させて、90%以上の細胞が透過化および染色されるまでステップ1-5を繰り返してください。セクションI-IVでは、ここで決定した量のDigitonin Solution #16359を使用してください。
詳細なトラブルシューティングガイドについては、https://cellsignal.com/learn-and-support/troubleshooting/cutandtag-troubleshooting-guideをご覧ください。
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U.S. Patent No. 11,733,248, foreign equivalents, and child patents deriving therefrom.
Protocol Id: 2745
ヒト, マウス, ラット, Monkey (サル)
Xenopus (アフリカツメガエル), Zebrafish (ゼブラフィッシュ)
Monoclonal antibody is produced by immunizing animals with a synthetic peptide corresponding to the amino terminus of histone H3 in which Lys27 is tri-methylated.
The nucleosome, made up of four core histone proteins (H2A, H2B, H3, and H4), is the primary building block of chromatin. Originally thought to function as a static scaffold for DNA packaging, histones have now been shown to be dynamic proteins, undergoing multiple types of post-translational modifications, including acetylation, phosphorylation, methylation, and ubiquitination (1). Histone methylation is a major determinant for the formation of active and inactive regions of the genome and is crucial for the proper programming of the genome during development (2,3). Arginine methylation of histones H3 (Arg2, 17, 26) and H4 (Arg3) promotes transcriptional activation and is mediated by a family of protein arginine methyltransferases (PRMTs), including the co-activators PRMT1 and CARM1 (PRMT4) (4). In contrast, a more diverse set of histone lysine methyltransferases has been identified, all but one of which contain a conserved catalytic SET domain originally identified in the Drosophila Su(var)3-9, Enhancer of zeste, and Trithorax proteins. Lysine methylation occurs primarily on histones H3 (Lys4, 9, 27, 36, 79) and H4 (Lys20) and has been implicated in both transcriptional activation and silencing (4). Methylation of these lysine residues coordinates the recruitment of chromatin modifying enzymes containing methyl-lysine binding modules such as chromodomains (HP1, PRC1), PHD fingers (BPTF, ING2), tudor domains (53BP1), and WD-40 domains (WDR5) (5-8). The discovery of histone demethylases, such as PADI4, LSD1, JMJD1, JMJD2, and JHDM1, has shown that methylation is a reversible epigenetic marker (9).
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