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免疫組織化学染色解析

免疫組織化学染色 (IHC) 実験の目的は、組織構造の空間的構造を維持しつつ、組織内の目的の標的分子を視覚化することです。IHC結果の解析は目視、またはソフトウェアを利用して行います。

サンプルを視覚化する

IHCサンプルは、抗体で標的分子を可視化することにより、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡で観察できます。

標的を蛍光色素で可視化した場合は、特別な制限が無ければ共焦点イメージングシステムやマルチスペクトルイメージングシステムで観察できます。抗体パネルサイズが小さい (1-3種類の標的) 場合は、従来のカメラで良好な画像が得られます。パネルサイズか大きい (4種以上の標的​) 場合には、マルチスペクトルカメラが必須です。マルチスペクトルイメージングシステムのサポートソフトウェアにより、励起/蛍光スペクトルに重複のある複数の蛍光色素 (および色素原) を区別した検出や、優れた分解能を持つマルチプレックス解析が可能になります。

以下に示す、マルチスペクトルシステムと従来のカメラで撮影された広視野イメージの比較をご覧ください。

IHCマルチスペクトルと従来型の比較

PD-L1, CD3ε, CD8α Multiplex IHC Panel：パラフィン包埋ヒト乳がんサンプルを、PD-L1 (E1L3N) Rabbit Monoclonal Antibody #13684 (緑)、CD3 epsilon (D7A6E) Rabbit Monoclonal Antibody #85061(黄)、CD8 alpha (C8/144B) Mouse Monoclonal Antibody #70306 (赤) を用いて3プレックスの蛍光mIHCで解析しました。DAPI #8961 (蛍光DNA色素) は青の疑似カラーで示しています。

IHCの結果を理解する

免疫組織化学解析において標的に対する特異性を確認するには、複数の検証ステップが必要です。CSTの科学者は、お客様が特異的な染色画像を取得できるように、IHC抗体を様々な方法で検査し、個々の抗体に必要な検証を実施しています。

検討すべき項目には、シグナルの強さやバックグラウンド、適切な局在が挙げられます。これらは陽性染色と陰性染色の評価に役立つ情報源となります。

CSTのIHC推奨抗体の特異性および正確性の検証方法の詳細は、こちらをクリックしてご覧ください。

シグナル強度とバックグラウンド

IHC実験におけるシグナル強度とバックグラウンドに影響を与え得る要素は、サンプルの保管から試薬の品質まで多岐に渡ります。

良好なIHC結果を得るために、検証済みの感度と特異性の高い一次抗体が必要であるは、言うまでもありません。しかし、一次抗体以外の試薬の選択も、IHC実験でのシグナル強度に大きな影響を与えます。各抗体専用のIHCプロトコールに記載されている希釈率や、SignalStain® Antibody Diluent #8112、SignalStain® Boost Detection Reagent、HRP標識二次抗体 (ラビット#8114、マウス#8125)、SignalStain® DAB Substrate Kit #8059などの試薬をご利用いただくことにより、シグナル強度が改善されることがあります。

強力な陽性シグナルを得ることに加え、バックグラウンドシグナルを低減することも重要です。SignalStain® Boost Detection Reagents, HRP (ラビット#8114、マウス#8125) など、ポリマーベースの検出試薬をご利用いただくことで、細胞内在性ビオチン由来のバックグラウンド染色を顕著に低減することができ、結果を改善できます。また、5% Normal Goat Serum液を、1X TBST #9997、Normal Goat Serum #5425で調製し、一次抗体反応前に30分間、適切なブロッキングを行うことでバックグラウンドが低減することがあります。

IHC PLK1

PLK1 (208G4) Rabbit Monoclonal Antibody #4513： パラフィン包埋ヒト結腸がん組織を#4513を用いてIHC分で解析しました。図に示す通り、段階的な試薬の変更によってIHCの結果に大きな差が生じることが分かります。

適切な局在の確認

IHC解析の主な利点の1つは、適切な細胞の種類や細胞内区画内の局在などといった組織の空間的構造を維持しつつ、標的を見ることができる点です。

CSTにとって適切な部位が染色されていることの確認は、抗体検証のみならず、すべてのIHC実験において不可欠なプロセスです。適切な染色が確認できない場合は、The Human Protein Atlasなどのリソースや、RNAデータなどの直交アプローチが役立ちます。

陽性と陰性の判断について

陽性または陰性を自信を持って評価するためには、シグナルの強度やバックグラウンド、局在など染色から得られる情報を統合して考える必要があります。染色の試薬や方法が適切に機能していることを評価するために有効な手段の1つに、IHCコントロールスライドの活用が挙げられます。

CSTは免疫組織化学染色のコントロールとして、ホルマリン固定/パラフィン包埋細胞ペレットのコントロールスライドをご用意しています。各スライドには陽性および陰性のペレットが、各セットには5枚のスライドが含まれています。

CSTのIHCコントロールスライドは、こちらからご覧いただけます。