ただ今実施中のプロモーション | 詳細はこちら >>

抗体検証における戦略:異種戦略

タンパク質の発現が非常に低いか知られていない抗原標的の場合、抗体の検証には、組換えタンパク質または代替細胞株における外因性発現が必要かもしれません。内因性システムの方がin vivo条件に似ており好まれるものの、異種戦略にはいくつかのメリットがあります。

まず、異種戦略は抗体のタンパク質アイソフォームまたは保存されているファミリーメンバーとの交差反応性を確認するのに使用することができ、抗原相同性に基づく抗体の標的外結合の可能性に関する情報を得ることができます。異種戦略は、発現または希釈による標的タンパク質のタイトレーションを通して、抗体の感度を試験するために使用することもできます。

異種戦略の他の使用方法としては、免疫沈降で機能する抗体の能力の検証や、ウェスタンブロットアプリケーションの標準ポジティブコントロールを生成することなどが挙げられます。さらに、微妙に異なる形態の多様なタンパク質を発現させる選択肢があるため、異種戦略では部位特異的変異に対する抗体の特異性を検証することができます。

組換えタンパク質

組換えタンパク質の一般的な使用方法は、タンパク質ファミリーのうち1つ以上に対する抗体の特異性の検証です。PKCδ (D10E2) Rabbit mAbの特異性を確認するため行った、9つの異なる組み換えPKCアイソフォームのウェスタンブロット解析を示した図1が、この良い例です。この場合、抗体の結合はアイソフォーム特異的であり、他の試験している組み換えアイソフォームに対する標的外結合は観察されません。

図2ではやや異なる方法を採り、14-3-3 (pan) 抗体のpan-reactivityを示しました。ウェスタンブロットのデータは、試験された6つの組み換えアイソフォームすべてを抗体が認識したことを示しており、アイソフォームの反応性を示すエビデンスとなっています。重要なことに、ローディングコントロールを含めたことにより、バンドの強度における違いがタンパク質のロードによるものであり、異なるアイソフォームに対する抗体の親和性の違いによるものではないことが分かります。

ここでの重要なポイントは、組換えタンパク質またはペプチドアレイは抗体特異性と交差反応性を判断するために使用できるものの、これらのアッセイは人工的な性質を持つため、この2つの種類の方法から得られる結果は誤解を招くことがあります。さらにこれらのシステムの主な特色の一部は現在標準化が行われておらず、この事実からも異種戦略は、このハンドブックに記述した他の保証方法で裏付ける必要性があることが分かります

PKCδ (D10E2) (上) またはGST (91G1) (下) を用いた、バクテリアによって発現した、GSTタグ付けされた、PKCアイソフォームのWB解析。PKCδへの特異性を示しています。

図1 PKCδ (D10E2) (上) またはGST (91G1) (下) を用いた、バクテリアによって発現した、GSTタグ付けされた、PKCアイソフォームのWB解析。PKCδへの特異性を示しています。

14-3-3 (pan) (上) またはGST (91G1、下) を用いた精製した組み換えGSTタグ付け14-3-3アイソフォームのWB解析。アイソフォームの交差反応性が示されています。

図 2 14-3-3 (pan) (上) またはGST (91G1、下) を用いた精製した組み換えGSTタグ付け14-3-3アイソフォームのWB解析。アイソフォームの交差反応性が示されています。

外因性発現

外因性システム内で目的の抗原標的を発現するために設計されたDNAプラスミドは、組換えタンパク質の使用の人気のある代替法です。この戦略も主にアイソフォーム、ホモログ、およびオルソログとの抗体特異性と交差反応性を判断するために使われます。この方法で発現したタンパク質は、ウェスタンブロットまたは免疫蛍光細胞染色など確立された技術で簡便に解析できます。

外因性発現はエピトープタグ、哺乳類細胞に内因的に発現されないタンパク質、または限られた条件下のみで、またはまれな細胞集団内で発現するタンパク質を検証するのに必要なステップです。このような標的は内因性システム内では解析できないため、抗体特異性を確認するためには外因性発現が必要不可欠です。

図3は、多様なMyc/DDKでタグ付けされたMAGEアイソフォームを発現する構造物でのトランスフェクションの後、293T細胞から調製したライセートを用いた、MAGE-A3抗体のウェスタンブロッティング解析を示しています。MAGE-A3は、多様な腫瘍細胞に発現することの多い核タンパク質で、293Tにより内在的に発現されることはありません。このデータはMAGE-A3に対する抗体特異性を示しており、DYKDDDK抗体を使いトランスフェクションが成功しており、ローディングコントロールとして使用したβ-Actin Antibodyが示されています。

図4では、非天然的に発現したタンパク質Cas9に対する抗体の検証が、その目的とする実験使用と一致したモデル内に示されています。ここではmycでタグ付けされたCas9を、Cas9 (S. pyogenes) (E7M1H) rabbit mAbを用いて293T細胞内にトランスフェクトし免疫細胞化学染色を行いました。cDNAの発現を確認するため、Myc-Tag (9B11) Mouse mAbを使用しました。

MAGE-A3 (E9S4X) (上)、DYKDDDK Tag Antibody (中)、およびβ-Actin (D6A8) (下) を用いた、擬似トランスフェクトされた (-) 、または全長ヒトMAGE-A2 (hMAGEA2-Myc/DDK)、Myc/DDKでタグ付けされた全長ヒトMAGE-A3 (hMAGE-A3-Myc/ DDK)、Myc/DDKでタグ付けされた全長ヒトMAGE-A4 (hMAGE-A4-Myc/DDK)、Myc/ DDKでタグ付けされた全長ヒトMAGE-A6 (hMAGE-A6-Myc/DDK)、Myc/DDKでタグ付けされた全長ヒトMAGE-A10 (hMAGE-A10-Myc/DDK)、およびMyc/DDKでタグ付けされた全長ヒトMAGE-A12 (hMAGE-A12-Myc/DDK) を発現する構造物でトランスフェクトされた (+) 293T細胞からの抽出物のWB解析。

図 3 MAGE-A3 (E9S4X) (上)、DYKDDDK Tag Antibody (中)、およびβ-Actin (D6A8) (下) を用いた、擬似トランスフェクトされた (-) 、または全長ヒトMAGE-A2 (hMAGEA2-Myc/DDK)、Myc/DDKでタグ付けされた全長ヒトMAGE-A3 (hMAGE-A3-Myc/ DDK)、Myc/DDKでタグ付けされた全長ヒトMAGE-A4 (hMAGE-A4-Myc/DDK)、Myc/ DDKでタグ付けされた全長ヒトMAGE-A6 (hMAGE-A6-Myc/DDK)、Myc/DDKでタグ付けされた全長ヒトMAGE-A10 (hMAGE-A10-Myc/DDK)、およびMyc/DDKでタグ付けされた全長ヒトMAGE-A12 (hMAGE-A12-Myc/DDK) を発現する構造物でトランスフェクトされた (+) 293T細胞からの抽出物のWB解析。

MAGE-A4 (E7O1U) (上) またはMAGE-A4 Antibody (下) を用いた、パラフィン包埋ヒト扁平上皮細胞肺がんのIHC解析。これら2つの抗体は、ヒトMAGE-A4上の独立した、独特のエピトープを検出します。両方の抗体で得られた染色のパターンが類似しており、これが染色の特異性を確認するのに役立ちます。

図 4 Cas9 (S. pyogenes) (E7M1H) (緑色) およびMycタグ (9B11) (赤色) を用いてmycでタグ付けされたCas9 (S. pyogenes) 構造物で一過的にトランスフェクトした293T細胞の共焦点ICC解析。緑色と赤色のシグナルの共局在化が、合成画像では黄色に見えます (右下)。サンプルは、ProLong® Gold Antifade Reagent with DAPI (青) にマウントされました。

部位特異的変異体の検出

異種戦略は、限りない数の構造物を発現させることができるため、野生型タンパク質の発現に限られません。部位特異的抗体の特異性は、バクテリアまたは哺乳類細胞に外因的に・組み換え的に発現されたタンパク質の部位特異的な変異体を使って確認できます。

この概念を説明するために、図5では、Thr359-リン酸化の形態のp90RSKタンパク質に対するPhospho-p90RSK (Thr359) (D1E9) Rabbit mAbの特異性を示しています。この場合、Thr359からAla (T359A) への変異体、Ser362 からAla (S362A) への変異体、または二重変異体 (T359A/S362A)、またp90RSKファミリーメンバーであるRSK2およびRSK3の野生型タンパク質を発現する細胞から調製されたライセートを調査するために、抗体を使用しました。

これらの結果は、トレオニン部位に対する特異性と、他のファミリーメンバー上の保存された部位を同等に検出する能力という、抗体の2つの重要な特徴を強調しています。このようなタイプの実験はほとんど行われないか、供給会社の大半に忘れられています。

異種戦略は、抗原標的の非天然的発現に依存するという点で他の特性からは顕著に異なるため、抗体の特異性と感度に関し意義のある知識を得るには、他の検証戦略と組み合わせることが大変重要です。異種戦略は、単独で使用すると誤解を招くことがありますが、他の保証方法と組み合わせて使うと、非常に強力な抗体検証法となります。

Phospho-p90RSK (Thr359) (D1E9) を用いた、擬似トランスフェクトされた、または野生型 (WT) RSK1、RSK2、およびRSK3、または示唆された部位特異的変異を発現する構造物でトランスフェクトされた293T細胞からの抽出物のWB解析。RSK1 (Thr359)、RSK2 (Thr365)、およびRSK3 (Thr356) の抗体のリン酸化特異的反応性を示しています。

図 5 Phospho-p90RSK (Thr359) (D1E9) を用いた、擬似トランスフェクトされた、または野生型 (WT) RSK1、RSK2、およびRSK3、または示唆された部位特異的変異を発現する構造物でトランスフェクトされた293T細胞からの抽出物のWB解析。RSK1 (Thr359)、RSK2 (Thr365)、およびRSK3 (Thr356) の抗体のリン酸化特異的反応性を示しています。

その他のCSTの抗体検証における戦略を見る

Powered by Translations.com GlobalLink OneLink SoftwarePowered By OneLink